【摘要】：研究背景 圍產(chǎn)期多種因素可導(dǎo)致胎兒或新生兒不同程度的缺氧性腦損傷,多見于圍產(chǎn)期窒息。腦部受到缺氧損傷可能會(huì)導(dǎo)致終生的智力障礙和行為能力喪失,如自閉癥譜系障礙、腦性癱瘓、抑郁、癲癇和智力缺陷等。缺氧引起的腦損傷機(jī)制一直未能充分闡明,且目前尚無有效的藥物及治療方法改善圍產(chǎn)期缺氧所致的腦損傷。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,雖然對于新生兒缺氧性腦損傷的研究已有一定的進(jìn)展,但要達(dá)到完全闡明發(fā)病機(jī)制并最終有效治療的目的,仍需要長期進(jìn)行大量的研究工作。深入研究新生兒缺氧缺血性腦損傷發(fā)病機(jī)制、尋找有效的防治方法是國內(nèi)外兒科領(lǐng)域的重要課題。 大多數(shù)疾病的深入研究往往得益于動(dòng)物疾病模型的有效建立,缺氧性腦損傷也是如此。近年來,新興的模式生物——斑馬魚迅速成為科研者所青睞的模式生物,其在研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用是其他模式生物難以取代的：與線蟲、果蠅等經(jīng)典模式生物相比,斑馬魚作為一種脊椎動(dòng)物,在基因組、蛋白質(zhì)組、胚胎發(fā)育以及疾病發(fā)病機(jī)制等方面均表現(xiàn)出與人類相似性高的特點(diǎn)；與小鼠相比,斑馬魚具有體積小、繁殖能力強(qiáng)、繁殖周期短、生長迅速、體外受精、胚胎透明等優(yōu)點(diǎn),因此可在體直觀觀察各器官系統(tǒng)發(fā)育過程,有利于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的研究及神經(jīng)營養(yǎng)藥物的高通量篩選。利用斑馬魚這一模式生物研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育并建立缺氧性腦損傷模型,為今后缺氧性腦損傷發(fā)生機(jī)制的深入探索、新通路的發(fā)現(xiàn)及新藥物的高通量篩選提供新的理論依據(jù)。 研究目的 1.模擬缺氧窒息環(huán)境,建立斑馬魚幼魚缺氧性腦損傷模型,為新生兒缺氧性腦損傷提供經(jīng)濟(jì)、高效、便捷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型； 2.比較急、慢性缺氧時(shí)斑馬魚幼魚腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)以及HIF-1α、EPO、p53表達(dá)的變化,分析斑馬魚幼魚在急、慢性缺氧環(huán)境中腦組織的損傷機(jī)制,為進(jìn)一步從基因水平探討斑馬魚幼魚缺氧性腦損傷發(fā)生機(jī)制提供新的思路； 3.比較缺氧前、后斑馬魚幼魚腦組織神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因nestin、mbp、syn2a的表達(dá)差異,初步探討差異表達(dá)的基因在缺氧后自身修復(fù)過程中的調(diào)控機(jī)制,為新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供新的靶點(diǎn)。 研究方法 同一批次斑馬魚產(chǎn)下的6dpf幼魚隨機(jī)分為正常對照組、慢性缺氧組和急性缺氧組。首先將慢性缺氧組預(yù)先放入缺氧裝置,再向水中充入高純氮?dú)膺M(jìn)行缺氧,到達(dá)實(shí)驗(yàn)終止時(shí)間點(diǎn),將所有缺氧后的幼魚撈出,即慢性缺氧組；當(dāng)水中溶氧量小于0.5mg/L時(shí),將急性缺氧組放入缺氧裝置中,建立斑馬魚幼魚急性缺氧性腦損傷模型。采用神經(jīng)行為學(xué)觀察、HE染色觀察腦組織病理變化等方法,對斑馬魚幼魚缺氧模型進(jìn)行評價(jià)；通過活體成像技術(shù)觀測各組幼魚的存活狀況、形態(tài)、心率(heart rate, HR)和運(yùn)動(dòng)能力等指標(biāo)；HE及甲苯胺藍(lán)神經(jīng)染色后,觀察受損腦組織病理形態(tài)的改變；各氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測試劑盒測定各組斑馬魚幼魚腦組織一氧化氮(NO)濃度、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性等氧化應(yīng)激指標(biāo),探索缺氧對斑馬魚幼魚腦組織損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制；采用吖啶橙染色觀察各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚幼魚腦部細(xì)胞的凋亡情況,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)的方法,對不同缺氧組斑馬魚幼魚腦組織HIF-1α、EPO、p53基因表達(dá)以及缺氧前后nestin、mbp、syn2a基因表達(dá)變化進(jìn)行差異性分析。結(jié)果 1.斑馬魚幼魚缺氧性腦損傷模型和腦組織損傷評估：斑馬魚幼魚缺氧后心率較正常組有明顯差異(p0.05),出現(xiàn)活力下降、游程縮短、靜止不動(dòng)等神經(jīng)行為改變；正常對照組幼魚腦組織結(jié)構(gòu)形態(tài)無異常改變,缺氧組斑馬魚幼魚腦組織細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體,HE染色可見缺氧組幼魚腦室萎縮,部分神經(jīng)元腫脹,細(xì)胞收縮變圓,胞漿濃縮等病理變化。 2.急性缺氧組和慢性缺氧組缺氧損傷程度對比 a)正常對照組、慢性缺氧組、急性缺氧組心率總體均值存在差異(p0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。急性缺氧組心率較正常對照組偏快,而慢性缺氧組則較正常對照組慢； b)慢性缺氧組與急性缺氧組缺氧后復(fù)蘇時(shí)間存在差異(p0.05),急性缺氧組幼魚缺氧后復(fù)蘇時(shí)間較慢性缺氧組短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 c)缺氧后14天內(nèi),正常對照組、慢性缺氧組、急性缺氧組的中位生存時(shí)間(天)分別為13.00、1.00、7.00,生存曲線整體Log-Rank檢驗(yàn)分析各組生存曲線水平間的總體生存率存在差異(p0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.斑馬魚幼魚各組腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 a)慢性缺氧組和急性缺氧組斑馬魚幼魚腦組織NO濃度較正常對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。慢性缺氧組幼魚腦組織NO濃度較急性缺氧組高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 b)慢性缺氧組和急性缺氧組斑馬魚幼魚腦組織MDA含量較正常對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。慢性缺氧組幼魚腦組織MDA含量較急性缺氧組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 c)慢性缺氧組和急性缺氧組斑馬魚幼魚腦組織SOD活性較正常對照組均明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。各缺氧組之間,慢性缺氧組幼魚腦組織SOD活性較急性缺氧組明顯減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 4.正常對照組、慢性缺氧組、急性缺氧組缺氧反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá) a)慢性缺氧組HIF-1α mRNA的相對表達(dá)量是0.674±0.048,急性缺氧組HIF-1αmRNA的相對表達(dá)量是1.422±0.136,慢性缺氧組較對照組HIF-1α mRNA的表達(dá)水平下調(diào),而急性缺氧組則上調(diào)了1.422倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 b)慢性缺氧組EPO mRNA的相對表達(dá)量是0.698±0.079,急性缺氧組EPOmRNA的相對表達(dá)量是3.539±0.811,慢性缺氧組較對照組EPO mRNA的表達(dá)水平下調(diào),而急性缺氧組則上調(diào)了3.539倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 c)慢性缺氧組p53mRNA的相對表達(dá)量是0.724±0.097,急性缺氧組p53mRNA的相對表達(dá)量是1.651±0.184,慢性缺氧組較對照組p53mRNA的表達(dá)水平下調(diào),而急性缺氧組則上調(diào)了1.651倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05) 5.正常對照組、慢性缺氧組和缺氧復(fù)蘇組神經(jīng)特異性基因的表達(dá) a)慢性缺氧組nestin mRNA的相對表達(dá)量是0.790±0.055,缺氧復(fù)蘇組nestin mRNA的相對表達(dá)量是2.622±0.617,慢性缺氧組較對照組nestin mRNA的表達(dá)水平下調(diào),而缺氧復(fù)蘇組則上調(diào)了2.622倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 b)慢性缺氧組mbp mRNA的相對表達(dá)量是0.710±0.060,缺氧復(fù)蘇組mbpmRNA的相對表達(dá)量是1.555±0.0665,慢性缺氧組較對照組mbp mRNA的表達(dá)水平下調(diào),而缺氧復(fù)蘇組則上調(diào)了1.555倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 c)慢性缺氧組syn2a mRNA的相對表達(dá)量是0.57±0.126,缺氧復(fù)蘇組syn2amRNA的相對表達(dá)量是0.623±0.037,慢性缺氧組和缺氧復(fù)蘇組syn2a mRNA的表達(dá)水平較正常對照組均下調(diào),缺氧復(fù)蘇組較慢性缺氧組有所升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論 1.通過將斑馬魚幼魚置于充入高純氮?dú)狻⑷苎趿康偷乃h(huán)境中的方法,可建立缺氧性腦損傷模型。 2.急、慢性缺氧均可對斑馬魚幼魚腦組織造成氧化應(yīng)激損傷,氧化應(yīng)激是導(dǎo)致斑馬魚幼魚缺氧后腦組織損傷的機(jī)制之一,NO的濃度、MDA的含量以及SOD的活性在氧化應(yīng)激所致的缺氧性斑馬魚幼魚腦組織損傷的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。 3.急、慢性缺氧時(shí),斑馬魚幼魚腦損傷的程度不同,慢性缺氧時(shí)腦損傷更為嚴(yán)重；急、慢性缺氧時(shí),HIF-1α、EPO、p53基因相關(guān)的調(diào)控機(jī)制可能不同。 4.斑馬魚幼魚缺氧損傷后具有一定的自身修復(fù)能力,可能是通過對腦組織nestin基因調(diào)控干細(xì)胞分化、mbp基因促進(jìn)髓鞘形成而發(fā)揮損傷修復(fù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R714.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李小泉;杜久林;;幼年斑馬魚的視覺系統(tǒng)與捕食行為[J];遺傳;2013年04期

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本文編號(hào)：2497510