發(fā)布時(shí)間：2019-05-22 07:38

【摘要】：目的:1.觀察�；撬釋�(duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響及其初步機(jī)制。2.觀察�；撬釋�(duì)人宮頸癌細(xì)胞自噬的影響及其初步機(jī)制。方法:1.MTT法檢測Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM,320 mM)分別處理宮頸癌細(xì)胞系HeLa及SiHa 24 h,48 h,72 h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響,以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系。2.采用Western blotting法檢測Tau(0 mM,20 mM,40 m M,80 mM,160 mM)及CQ 20μM分別處理宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa 48 h后,凋亡相關(guān)蛋白MST1、Bax、Bcl-2和自噬相關(guān)蛋白LC3-II,LC3-I,Beclin1變化,評(píng)價(jià)Tau對(duì)凋亡和自噬的影響。3.采用RT-qPCR檢測Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 m M)及CQ 20μM分別處理宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa 48 h后,MST1,Bax,Bcl-2,Caspase-3凋亡相關(guān)mRNA及AKT,Beclin1自噬相關(guān)mRNA的表達(dá)水平,評(píng)價(jià)Tau對(duì)凋亡和自噬的影響。4.收集細(xì)胞并用PBS沖洗,采用Annexin V-FITC/PI雙染色細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 m M),CQ 20μM及高表達(dá)MST1基因?qū)iHa細(xì)胞凋亡的影響。5.用Tau(0 mM,40 mM)處理對(duì)數(shù)生長期HeLa細(xì)胞48 h后,單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染色觀察自噬泡的形成。6.將GFP-RFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa和SiHa細(xì)胞,用熒光顯微鏡觀察Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80m M,160 mM),CQ 20μM處理48 h后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)和紅色熒光斑點(diǎn)的聚集情況檢測自噬水平。結(jié)果:1.MTT法顯示Tau對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa具有增殖抑制作用,并呈時(shí)間-劑量依賴性,Tau對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa增殖抑制作用明顯增加(P0.01)。計(jì)算Tau作用人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa后的IC50值發(fā)現(xiàn),Tau對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制能力大于SiHa細(xì)胞。2.Western Blot顯示在HeLa細(xì)胞中,Tau 40 mM組相對(duì)其它濃度組能夠顯著升高M(jìn)ST1蛋白表達(dá)(P0.01),在SiHa細(xì)胞中,MST1蛋白表達(dá)隨著Tau濃度逐漸升高而升高。2種細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)均隨著Tau濃度逐漸升高而降低(P0.01),Bax蛋白表達(dá)均隨著Tau濃度逐漸升高而升高(P0.05)。而對(duì)自噬標(biāo)志性蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)情況,2種細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)均隨著Tau濃度逐漸升高而降低(P0.01),胞漿型LC3(即LC3-I)轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型LC3(即LC3-II)隨著Tau濃度逐漸升高而減少,LC3-II\LC3-I比值減少(P0.01)。3.RT-qPCR顯示在HeLa和SiHa細(xì)胞中,Bax和MST1的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01),Caspase-3稍有上調(diào)(P0.05),Bcl-2的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01),AKT的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01),Beclin1的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.高濃度Tau誘導(dǎo)凋亡SiHa細(xì)胞凋亡。體外介導(dǎo)p-EGFP-MST1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SiHa細(xì)胞凋亡率升高,與牛磺酸(160 mM)聯(lián)合處理時(shí),細(xì)胞凋亡率的升高更明顯(P0.01)5.MDC可被細(xì)胞吸收并選擇性地結(jié)合到自噬囊泡膜上,使自噬泡在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)為黃綠色或深綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。Tau 40 mM MDC陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度及細(xì)胞內(nèi)MDC熒光顆粒數(shù)目較Control組明顯減少,提示Tau能抑制HeLa和SiHa細(xì)胞自噬。6.在HeLa和SiHa細(xì)胞中Tau處理組較Control組、CQ 20μM組綠色熒光斑點(diǎn)和紅色熒光斑點(diǎn)的數(shù)量明顯減少,提示Tau能抑制HeLa和SiHa細(xì)胞自噬。結(jié)論:1.Tau能抑制人宮頸癌HeLa和Si Ha細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。2.Tau能促進(jìn)人宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制是通過上調(diào)MST1、Bax蛋白表達(dá)和下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。.3.Tau能抑制人宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞自噬,Tau抑制人宮頸癌細(xì)胞自噬的機(jī)制是通過下調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)及LC3-II\LC3-I比值及上調(diào)AKT表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：2482780