發(fā)布時(shí)間：2019-05-20 07:06

【摘要】：研究背景 卵巢上皮癌(EOC)是致死率最高的婦科惡性腫瘤,其中75%的患者診斷時(shí)已為晚期(Ⅲ～Ⅳ)。在理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔助鉑類(lèi)藥物為主的聯(lián)合化療后,約60-80%的患者發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā),晚期卵巢癌患者的中位生存時(shí)間僅為16-22個(gè)月,5年生存率約為30%。腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療藥物產(chǎn)生耐受性被認(rèn)為是造成這一現(xiàn)象的主要原因之一。近期研究的靶向藥物及小分子化合物的臨床實(shí)驗(yàn)均未能顯著改善卵巢癌患者的預(yù)后。隨著腫瘤基因組圖譜的揭示,學(xué)者們對(duì)卵巢癌的研究主要致力于基因組及表觀(guān)遺傳學(xué)的變化對(duì)臨床預(yù)后的影響。但是卵巢癌化療耐藥及腫瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制仍不清楚,從而成為卵巢癌治療中的最大障礙。 干細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)一類(lèi)具有自我更新能力和多向分化潛能的特殊細(xì)胞。根據(jù)其來(lái)源和分化能力,主要分為,胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、以及成體干細(xì)胞。隨著腫瘤生物學(xué)的發(fā)展,上世紀(jì)學(xué)者們提出了腫瘤干細(xì)胞(CSCs)理論。大量研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中存在的極少量的CSCs,其既擁有類(lèi)似干細(xì)胞自我更新及分化的特性,又維持著腫瘤細(xì)胞的致瘤性及細(xì)胞異質(zhì)性,在腫瘤中長(zhǎng)期處于靜息狀態(tài),可以逃避化療藥的殺傷,導(dǎo)致腫瘤的耐藥,疾病進(jìn)展及復(fù)發(fā)。早在1997年Bonnet等人分離出表型為CD34+CD38的白血病干細(xì)胞,首次在細(xì)胞水平上直觀(guān)證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在。隨后,CSCs理論在許多實(shí)體瘤如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌等中得到驗(yàn)證,并建立了一系列CSCs分離、富集、鑒定及分子機(jī)制研究的方法。目前,CSCs的分離及富集方法主要包括：側(cè)群細(xì)胞(side population, SP)的流式分選,根據(jù)特異性的CSCs表面標(biāo)記蛋白的流式分選,以及腫瘤球形體(sphere)的培養(yǎng)等。 近年來(lái),許多致力于尋找卵巢癌治療新途徑的學(xué)者們也將目光轉(zhuǎn)移到腫瘤干細(xì)胞,借鑒在其它實(shí)體瘤的研究中的成熟經(jīng)驗(yàn),探索了卵巢癌干細(xì)胞研究的新領(lǐng)域。目前對(duì)于卵巢癌干細(xì)胞的分選仍然是根據(jù)在其它實(shí)體瘤干細(xì)胞研究中的結(jié)果,采用表面標(biāo)記蛋白的流式分選技術(shù),使用最多的標(biāo)記物主要包括,CD133、CD117、CD44、 ALDH1、EPCAM、CD24、以及CD90等。雖然取得了一些研究進(jìn)展,但由于這些標(biāo)記物均來(lái)自于其它實(shí)體瘤干細(xì)胞的研究,其對(duì)卵巢癌干細(xì)胞的分離富集作用并不十分理想,仍然存在爭(zhēng)論。因此,尋找卵巢癌特異性表面標(biāo)記蛋白,成功分離并鑒定卵巢癌干細(xì)胞,對(duì)于未來(lái)卵巢癌的靶向治療可能具有重大意義。 本課題在前期工作中,采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記和以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)SP和非SP細(xì)胞的膜蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,成功篩選出卵巢癌干細(xì)胞表面標(biāo)記候選蛋白——跨膜蛋白30A (transmembrane protein30A，，簡(jiǎn)稱(chēng)TMEM30A或CDC50A),并在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)其表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的干細(xì)胞特性進(jìn)行了初步鑒定。本研究采用流式細(xì)胞分選及無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù),通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),在卵巢癌細(xì)胞系和卵巢癌患者的組織和腹水中驗(yàn)證CDC50A表面標(biāo)記陽(yáng)性(CDC50A+) EOC細(xì)胞的sphere形成能力,自我更新能力,分化能力及致瘤能力,檢測(cè)其對(duì)順鉑的耐藥性,并分析其表達(dá)與EOC患者臨床預(yù)后的關(guān)系。并初步探討雌激素在卵巢癌干細(xì)胞微環(huán)境中的作用及其對(duì)術(shù)后卵巢癌患者臨床預(yù)后的影響。 研究方法 1、運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)方法分析卵巢癌細(xì)胞系SKOV3, A2780, IGROV1, COC1, OVCAR3, ES2中CDC50A+細(xì)胞的比例。采用流式細(xì)胞儀分選CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞,驗(yàn)證其在HG-DMEM/10%FBS培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)后再次分化成其他亞群的能力。采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的方法檢測(cè)CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞sphere形成能力及sphere傳代能力,并運(yùn)用免疫熒光及流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)SKOV3sphere對(duì)CDC50A的富集作用。流式分選出CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞,分別等量梯度接種于NOD/SCID小鼠皮下,觀(guān)察成瘤速度,觀(guān)察終點(diǎn)為兩組成瘤率或成瘤大小出現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。待小鼠成瘤后,再次分選出兩群細(xì)胞接種小鼠,觀(guān)察成瘤情況。流式分析移植瘤中CDC50A+細(xì)胞的比例,檢測(cè)CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞體內(nèi)分化能力。 2、收集EOC患者卵巢癌組織及腹水,分離卵巢癌細(xì)胞,運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)方法分析原代卵巢癌細(xì)胞中CDC50A+細(xì)胞的比例。建立原代卵巢癌細(xì)胞sphere的培養(yǎng)方法,檢測(cè)原代卵巢癌CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞sphere形成能力及傳代能力。運(yùn)用免疫熒光及流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)原代卵巢癌sphere對(duì)CDC50A的富集作用。流式分選出CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞,分別等量梯度接種于NSG小鼠皮下,觀(guān)察成瘤速度,觀(guān)察終點(diǎn)為兩組成瘤率或成瘤大小出現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。待小鼠成瘤后,再次分選出兩群細(xì)胞接種小鼠,觀(guān)察成瘤情況。流式分析移植瘤中CDC50A+細(xì)胞的比例,檢測(cè)CDC50A+及CDC50A+細(xì)胞體內(nèi)分化能力。 3、MTT法驗(yàn)證SKOV3及ES2細(xì)胞系中CDC50A+及CDC50A-細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性差異,流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)不同濃度的順鉑對(duì)SKOV3/CDC50A+細(xì)胞的富集作用。流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)順鉑化療對(duì)EOC患者卵巢癌組織中CDC50A+細(xì)胞的富集作用；建立NOD/SCID小鼠卵巢癌移植瘤模型,檢測(cè)順鉑化療對(duì)小鼠移植瘤中CDC50A+細(xì)胞的富集作用。 4、運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)方法分析EOC患者卵巢癌原位灶及轉(zhuǎn)移灶中CDC50A+細(xì)胞的比例,流式分析處于臨床治療不同階段的EOC患者組織中CDC50A+細(xì)胞比例的分布情況,免疫組化分析76例EOC患者CDC50A蛋白的表達(dá)與臨床預(yù)后的相關(guān)性。 5、采用不同濃度的雌激素作用CDC50A+細(xì)胞,檢測(cè)雌激素在維持卵巢癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)及自我更新中的作用。結(jié)合臨床資料,回顧性分析術(shù)后激素替代治療對(duì)卵巢癌患者的復(fù)發(fā)及生存的影響。 研究結(jié)果 1、流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6種卵巢癌細(xì)胞株中均存在少量CDC50A+細(xì)胞群,其比例穩(wěn)定維持在0.4%～2%之間。流式分選出CDC50A+細(xì)胞亞群,在細(xì)胞分化條件下體外培養(yǎng)2周,再次流式分析發(fā)現(xiàn)CDC50A+細(xì)胞分化出CDC50A細(xì)胞,其陽(yáng)性率仍保持原來(lái)水平,而CDC50A細(xì)胞未能分化出CDC50A+細(xì)胞,表明CDC50A+細(xì)胞具有分化潛能。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)出SKOV3sphere,流式分選出CDC50A+及CDC50A-細(xì)胞,分別懸浮培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)CDC50A+細(xì)胞形成sphere的個(gè)數(shù)明顯多于CDC50A細(xì)胞,CDC50A+細(xì)胞形成的sphere能連續(xù)體外傳代至少4代,而CDC50A細(xì)胞形成的sphere幾乎不能傳代。免疫熒光與流式分析均證實(shí)CDC50A+細(xì)胞在SKOV3sphere表達(dá)顯著高于貼壁SKOV3細(xì)胞；體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了CDC50A+細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯強(qiáng)于CDC50A細(xì)胞,102個(gè)CDC50A+細(xì)胞即能使NOD/SCID小鼠成瘤,而至少104個(gè)CDC50A細(xì)胞才能使NOD/SCID小鼠成瘤。CDC50A+細(xì)胞移植瘤能夠在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代,而CDC50A細(xì)胞移植瘤不能傳代。HE染色顯示CDC50A+細(xì)胞移植瘤與第二代移植瘤的組織學(xué)類(lèi)型保持一致。流式分析顯示CDC50A+細(xì)胞移植瘤中CDC50A陽(yáng)性率保持不變,而CDC50A細(xì)胞移植瘤中幾乎無(wú)CDC50A+細(xì)胞,說(shuō)明CDC50A+細(xì)胞在體內(nèi)仍具有分化能力。 2、從原代卵巢癌組織及腹水中成功分離出卵巢癌細(xì)胞,流式分析顯示原代卵巢癌組織及腹水細(xì)胞中均存在CDC50A+細(xì)胞群。成功建立了原代卵巢癌細(xì)胞sphere培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)原代組織中CDC50A+細(xì)胞能形成sphere,并能連續(xù)傳代,而CDC50A細(xì)胞幾乎不能形成sphere;免疫熒光及流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)均證實(shí)CDC50A+細(xì)胞在原代卵巢癌sphere中的表達(dá)顯著增高。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了原代卵巢癌CDC50A+細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯強(qiáng)于CDC50A細(xì)胞,103個(gè)CDC50A+細(xì)胞仍能使NSG小鼠成瘤,而至少105個(gè)CDC50A細(xì)胞才能使NSG小鼠成瘤。CDC50A+細(xì)胞移植瘤能在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代,而CDC50A細(xì)胞移植瘤不能傳代；HE染色顯示原代CDC50A+細(xì)胞移植瘤與患者組織學(xué)類(lèi)型保持一致。流式分析顯示原代CDC50A+田胞移植瘤中CDC50A陽(yáng)性率保持不變,而CDC50A細(xì)胞移植瘤中幾乎無(wú)CDC50A+細(xì)胞,說(shuō)明原代CDC50A+細(xì)胞在體內(nèi)仍具有分化能力。 3、MTT法對(duì)細(xì)胞耐藥性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在SKOV3和ES2細(xì)胞系中CDC50A+細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性明顯高于CDC50A細(xì)胞。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),不同濃度的順鉑作用后的SKOV3細(xì)胞后,細(xì)胞總數(shù)減少,CDC50A陽(yáng)性率卻逐漸增高,而且CDC50A+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)基本不變。分析同一患者先期化療前后卵巢癌組織中CDC50A陽(yáng)性率,發(fā)現(xiàn)順鉑化療后CDC50A+細(xì)胞比例顯著增高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,接受順鉑化療后的小鼠移植瘤增長(zhǎng)速度顯著慢于未治療組,而移植瘤中CDC50A陽(yáng)性率卻顯著高于未治療組,進(jìn)一步證明了順鉑對(duì)CDC50A具有富集作用。 4、流式細(xì)胞學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn),EOC患者卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中CDC50A+細(xì)胞比例顯著高于原位灶。對(duì)處于臨床治療不同階段的EOC患者組織中CDC50A+細(xì)胞比例分析發(fā)現(xiàn),CDC50A+細(xì)胞在初治手術(shù)患者中平均比例為1.47%,在先期化療患者中為9.76%,而在復(fù)發(fā)的患者中為13.35%。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)76例EOC患者中22例患者CDC50A蛋白高表達(dá),54例患者CDC50A蛋白低表達(dá)或陰性表達(dá)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)CDC50A蛋白表達(dá)和術(shù)后殘余病灶是影響患者耐藥的獨(dú)立因素。Kaplan-Meier分析證實(shí)CDC50A蛋白高表達(dá)患者無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)顯著低于CDC50A蛋白低表達(dá)患者,中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間分別為10個(gè)月和17個(gè)月。Cox多元回歸模型分析顯示卵巢癌FIGO分期和CDC50A蛋白表達(dá)是影響PFS獨(dú)立因素,CDC50A蛋白高表達(dá)患者發(fā)生卵巢癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)患者的2.85倍(95%CI1.32-6.16,p0.01)。 5、采用不同濃度的雌激素作用CDC50A+細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其對(duì)sphere的生長(zhǎng)及自我更新能力均無(wú)顯著影響�；仡櫺圆±治鲲@示：HRT不是PFS及OS的獨(dú)立影響因素,而且不同HRT方案對(duì)EOC患者預(yù)后無(wú)明顯影響。殘余病灶大小及FIGO分期是影響無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立因素。FIGO分期還是影響總生存期的獨(dú)立因素。 結(jié)論 1、CDC50A+細(xì)胞在六種卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)穩(wěn)定在0.4%～2%之間,符合干細(xì)胞比例。卵巢癌細(xì)胞系中CDC50A+細(xì)胞群具有體內(nèi)外分化能力,sphere形成能力,自我更新能力等CSCs特性。CDC50A+細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤形成能力,并能在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代。 2、EOC患者原代卵巢癌細(xì)胞中能夠分離出CDC50A+細(xì)胞群,該細(xì)胞群具有體內(nèi)分化能力,sphere形成能力,自我更新能力等CSCs特性。原代卵巢癌細(xì)胞中的CDC50A+細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力,且能在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代。 3、卵巢癌細(xì)胞系、原代卵巢癌細(xì)胞、以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)順鉑對(duì)于CDC50A+細(xì)胞具有富集作用。 4、EOC患者卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中CDC50A+細(xì)胞比例顯著高于原位灶,表明CDC50A可能與卵巢癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。CDC50A陽(yáng)性細(xì)胞的比例在復(fù)發(fā)患者中最高,其次是先期化療患者,初治手術(shù)患者的表達(dá)比例最低,進(jìn)一步說(shuō)明CDC50A可能與患者耐藥及復(fù)發(fā)有關(guān)。臨床分析表明,CDC50A蛋白的表達(dá)是患者耐藥及復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素,高表達(dá)CDC50A的患者具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。 5、通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：雌激素在維持CDC50A+卵巢癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)及自我更新中無(wú)顯著作用,其并不是維持卵巢癌干細(xì)胞的重要因子。結(jié)合臨床資料,采用回顧性病例分析發(fā)現(xiàn)術(shù)后激素替代治療對(duì)卵巢癌患者的復(fù)發(fā)及生存無(wú)明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

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