【摘要】：研究背景卵巢癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤,其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中排列第三位,但死亡率卻位居首位�；颊咴缙跓o(wú)明顯自覺(jué)癥狀,臨床缺乏特異性的有效診斷方法,超過(guò)70%的患者初次就診時(shí)就已經(jīng)是晚期。這也是卵巢癌治療效果差,復(fù)發(fā)率和死亡率高的重要原因。因此尋找一個(gè)敏感的腫瘤標(biāo)記物及潛在的治療靶點(diǎn)對(duì)于提高卵巢癌臨床治療療效具有重要的意義。EPS8 (epidermal growth factor receptor pathway substrate 8, EPS8),表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)通路底物8,是一種廣泛表達(dá)的多域信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。有資料顯示其在線蟲(chóng)、果蠅、非洲蟾蜍以及人類細(xì)胞中均有表達(dá)。人類EPS8的編碼基因定位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)3-4帶,含有大約821個(gè)氨基酸,其相對(duì)分子量為97KD。有研究表明,在胚胎形成過(guò)程中,原始細(xì)胞向特異性神經(jīng)外胚層和身體器官的選擇性分化,以及細(xì)胞的增殖、多形應(yīng)答可能都與EPS8的表達(dá)有關(guān)。1999年,Alvarez等人實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在有絲分裂信號(hào)通路中有EPS8蛋白的存在。EPS8調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖的生物學(xué)特性為其參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展提供了分子生物學(xué)的依據(jù)。許多研究數(shù)據(jù)顯示,EPS8在胰腺癌、食管鱗癌、腺癌、口腔鱗癌、宮頸鱗癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯增高,與腫瘤進(jìn)展以及化療的敏感程度密切相關(guān)[14-18]。有專家認(rèn)為,可以通過(guò)EPS8蛋白的檢測(cè),作為判斷腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后的參考指標(biāo)。那么,EPS8蛋白在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起到了什么作用?目前國(guó)內(nèi)外研究仍未闡明。本實(shí)驗(yàn)以卵巢癌手術(shù)石蠟切片及卵巢癌細(xì)胞為研究對(duì)象,采用S-P免疫組化法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR)、蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)卵巢癌組織及細(xì)胞中EPS8蛋白的表達(dá),分析其表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理因素之間的相關(guān)性；其次,以p113.7質(zhì)粒為載體,成功構(gòu)建了p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒,為進(jìn)一步研究EPS8基因?qū)β殉舶┥飳W(xué)行為的影響提供了有效技術(shù)手段；最后,以卵巢癌細(xì)胞株SKOV3作為研究對(duì)象,觀察p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞周期及其對(duì)順鉑敏感性的變化,進(jìn)一步探索EPS8基因?qū)β殉舶┥飳W(xué)行為的影響。目的1.觀察EPS8蛋白在卵巢癌手術(shù)石蠟切片中的表達(dá)；2.觀察EPS8蛋白在卵巢癌不同細(xì)胞株中的表達(dá)；3.統(tǒng)計(jì)分析EPS8蛋白表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理因素之間的相關(guān)性；4.構(gòu)建p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒,觀察p113.7-EPS8 shRNA轉(zhuǎn)染前后卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞周期、順鉑敏感性等生物學(xué)行為的變化。方法及內(nèi)容1.免疫組化法檢測(cè)76例卵巢上皮性癌組織、15例上皮性卵巢良性腫瘤組織及15例正常卵巢組織石蠟切片中EPS8的表達(dá)。2. RT-PCR檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780、8910、8910/PM中EPS8的mRNA水平的表達(dá)情況。3. Western Blot檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780、8910、8910/PM中EPS8的蛋白水平的表達(dá)情況。4.利用重組質(zhì)粒技術(shù)構(gòu)建p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定。5.選取EPS8蛋白表達(dá)較高的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3,應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默EPS8蛋白的表達(dá)后,檢測(cè)P113.7-EPS8 shRNA對(duì)SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞周期、順鉑敏感性等生物學(xué)行為的影響。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果表明,卵巢癌組織中EPS8蛋白均有不同程度的表達(dá),細(xì)胞學(xué)定位主要為胞漿。在中晚期(Ⅲ+Ⅳ)卵巢癌患者中EPS8蛋白高表達(dá)的比例低于早期(Ⅰ+Ⅱ)卵巢癌患者,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(38.2%vs.66.7%,p0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者中EPS8蛋白高表達(dá)的比例低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者(37.7%vs.65.2%,p0.05)。此外,本研究數(shù)據(jù)表明,卵巢癌患者中EPS8蛋白表達(dá)水平與卵巢癌病理類型、細(xì)胞分化程度無(wú)顯著相關(guān)性(p0.05)。2.EPS8在不同卵巢癌細(xì)胞株中表達(dá)水平不同,A2780、SKOV3、8910細(xì)胞中表達(dá)水平較高,在8910/PM細(xì)胞中表達(dá)水平最低。在后續(xù)試驗(yàn)中,選擇EPS8表達(dá)水平較高的SKOV3作為研究對(duì)象。3.利用重組質(zhì)粒技術(shù)構(gòu)建p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒,測(cè)序鑒定序列正確,Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明,隨著p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng),EPS8蛋白表達(dá)水平顯著下降。4.MTT法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示,p113.7-EPS8 shRNA轉(zhuǎn)染后SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較Empty vector轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組顯著減慢,提示EPS8蛋白表達(dá)降低對(duì)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制增殖的作用。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期結(jié)果顯示,p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,G0/G1期比例顯著增高,S期比例顯著下降,提示EPS8蛋白表達(dá)下降能降低SKOV3細(xì)胞的DNA合成。6.MTT法檢測(cè)P113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后卵巢癌SKOV3細(xì)胞順鉑敏感性的變化結(jié)果表明,空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組的IC50值分別為32.18μM和34.87μM,而P113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后卵巢癌SKOV3細(xì)胞的IC50值為14.17μM,即EPS8蛋白表達(dá)降低后,SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性提高了約2.46倍。結(jié)論1.EPS8蛋白在卵巢上皮性癌組織中表達(dá)較高,主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)臨床病理因素的統(tǒng)計(jì)分析表明,卵巢癌組織中EPS8蛋白與卵巢癌疾病進(jìn)展相關(guān)。2. p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒特異性降低EPS8的表達(dá)水平后,顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖速度。3. pll3.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒特異性降低EPS8的表達(dá)水平后,能引起卵巢癌SKOV3細(xì)胞G0/G1期阻滯。4. p113.7-EPS8 shRNA重組質(zhì)粒特異性降低EPS8的表達(dá)水平后,顯著提高SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2475173