【摘要】：子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠20周之后新發(fā)的高血壓(舒張壓=90mm Hg)和大量蛋白尿(=300mg/24h),占妊娠并發(fā)癥的2%-8%,連同其他妊娠高血壓疾病一起構(gòu)成全球產(chǎn)婦死亡的主要原因[1,2]。盡管子癇前期的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明,但由于子癇前期的癥狀會(huì)隨著胎盤(pán)的娩出而減輕或消失,所以認(rèn)為胎盤(pán)在子癇前期發(fā)病中起關(guān)鍵作用。構(gòu)成胎盤(pán)的主要細(xì)胞是滋養(yǎng)細(xì)胞,它包括絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVT)。妊娠過(guò)程中,絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮肌層,并遷移至子宮螺旋動(dòng)脈,取代其內(nèi)皮細(xì)胞,引起螺旋動(dòng)脈重建,在胎盤(pán)形成和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。研究表明,絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足,引起胎盤(pán)著床過(guò)淺,血管重建障礙,導(dǎo)致子癇前期等妊娠期疾病的發(fā)生。自噬是細(xì)胞降解自身成分以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種生物學(xué)現(xiàn)象,在缺氧、免疫損傷、饑餓等條件下,通過(guò)自噬為細(xì)胞提供能量以利于細(xì)胞生存,但自噬不足或過(guò)度自噬都將影響細(xì)胞功能,從而參與多種疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),與正常妊娠孕婦相比,子癇前期患者胎盤(pán)組織中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ表達(dá)增加,表明胎盤(pán)組織中滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬活性增加參與子癇前期的發(fā)病。micro RNA-34a(miR-34a)在子癇前期的胎盤(pán)組織中表達(dá)降低,并且研究證實(shí)在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中,miR-34a可通過(guò)靶向調(diào)控HMGB1的表達(dá)而抑制細(xì)胞自噬。但在子癇前期中,miR-34a與HMGB1以及滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的關(guān)系尚未報(bào)道。目的探討miR-34a能否通過(guò)調(diào)節(jié)JAR和JEG-3細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞自噬,進(jìn)而研究miR-34a參與子癇前期發(fā)病的可能的機(jī)制。材料和方法1研究對(duì)象本研究選用人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系JAR和JEG-3細(xì)胞(購(gòu)買(mǎi)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司),培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng),所用培養(yǎng)基為含10%FBS、100U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基,待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2方法本研究利用RPMI1640培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí),用胰酶將細(xì)胞消化,接種至6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)約為1.0×105,接種完畢,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%時(shí),對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理。2.1 miR-34a對(duì)JAR和JEG-3細(xì)胞中HMGB1表達(dá)的影響JAR和JEG-3細(xì)胞各分5組:miR-34a mimics組(轉(zhuǎn)染miR-34a mimics)、NC組(轉(zhuǎn)染miR-34a mimics陰性對(duì)照)、miR-34a inhibitors組(轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitors)、INC組(轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitors陰性對(duì)照)和空白對(duì)照組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中HMGB1m RNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量。2.2缺氧對(duì)JAR和JEG-3細(xì)胞自噬的影響JAR和JEG-3細(xì)胞各分兩組:正常組(未加Co Cl2)、缺氧組(300μmol/L的Co Cl2處理),采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中HMGB1和LC3蛋白的相對(duì)表達(dá)量,用透射電鏡觀察各組細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量。2.3 miR-34a對(duì)JAR和JEG-3細(xì)胞自噬的影響兩株細(xì)胞分別分4組:miR-34a mimics組、NC組、miR-34a inhibitors組和INC組,各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用300μmol/L的Co Cl2進(jìn)行缺氧處理2小時(shí),誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬,然后利用Western Blot和透射電鏡分別檢測(cè)各組細(xì)胞中HMGB1和LC3蛋白的相對(duì)表達(dá)量及自噬小體數(shù)量改變。3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究所得數(shù)據(jù)用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以?x±s表示,多組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差檢驗(yàn),兩組數(shù)據(jù)分析時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以α=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果1轉(zhuǎn)染miR-34a mimics和inhibitors后JAR和JEG-3細(xì)胞中HMGB1m RNA和蛋白的表達(dá)水平JAR細(xì)胞中HMGB1 m RNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量:miR-34a mimics組(0.37±0.13,0.59±0.12)低于空白對(duì)照組(1.01±0.15,1.01±0.10)和NC組(1.11±0.34,0.91±0.08);miR-34a inhibitors組(1.62±0.25,1.47±0.13)高于空白對(duì)照組(1.01±0.15,1.01±0.10)和INC組(0.99±0.16,1.03±0.12),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。JEG-3細(xì)胞中HMGB1 m RNA和蛋白的表達(dá)水平:miR-34a mimics組(0.56±0.15,0.64±0.06)低于空白對(duì)照組(1.00±0.13,0.97±0.16)和NC組(1.00±0.15,0.92±0.13);miR-34a inhibitors組(2.12±0.59,1.37±0.05)高于空白對(duì)照組(1.00±0.13,0.97±0.16)和INC組(1.01±0.14,1.04±0.07),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2缺氧后JAR和JEG-3細(xì)胞中HMGB1和LC3的蛋白表達(dá)水平及自噬小體數(shù)量JAR細(xì)胞中,缺氧組HMGB1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅱ相對(duì)表達(dá)量(1.20±0.10,1.06±0.08)均高于正常組(0.62±0.07,0.45±0.13),缺氧組自噬小體的數(shù)量(0.90±0.87)也較正常組(0.20±0.42)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。JEG-3細(xì)胞中,缺氧組HMGB1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅱ表達(dá)水平(1.32±0.21,1.23±0.97)高于正常組(0.70±0.15,0.65±0.19),自噬小體數(shù)量(1.20±1.03)也多于正常組(0.10±0.32),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3轉(zhuǎn)染miR-34a mimics和inhibitors并缺氧處理后JAR和JEG-3細(xì)胞中HMGB1和LC3蛋白的表達(dá)水平JAR細(xì)胞中HMGB1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅱ相對(duì)表達(dá)量:miR-34a mimics組(0.56±0.12,0.48±0.02)均低于NC組(1.04±0.04,1.01±0.03),miR-34a inhibitors組(1.70±0.24,1.48±0.09)均高于INC組(0.82±0.17,0.99±0.06),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。JEG-3細(xì)胞中HMGB1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅱ的表達(dá)水平:miR-34a mimics組(0.48±0.18,0.32±0.87)均低于NC組(1.24±0.28,1.12±0.12),miR-34a inhibitors組(2.13±0.27,1.52±0.15)均高于INC組(1.46±0.21,1.07±0.11),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4轉(zhuǎn)染miR-34a mimics和inhibitors并缺氧處理后JAR和JEG-3細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量JAR和JEG-3細(xì)胞中自噬小體數(shù)量:miR-34a mimics組(0.10±0.32,0.10±0.31)分別少于NC組(0.70±0.82,1.00±0.82),miR-34a inhibitors組(1.40±0.84,1.50±1.08)分別多于INC組(0.40±0.52,0.50±0.53),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論miR-34a可能通過(guò)下調(diào)JAR和JEG-3細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞自噬。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R714.244

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳建波;吳秀燕;胡繼芬;;HMGB1、TLR4和NF-B在子癇前期患者胎盤(pán)組織及血漿中升高[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2015年01期

2 高麗;漆洪波;張雪梅;陳國(guó)慶;張華;;早發(fā)型子癇前期胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度自噬與侵襲功能的關(guān)系[J];中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志;2014年02期

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本文編號(hào)：2474273