【摘要】：背景和目的 卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤,具有高度侵襲性,且發(fā)病隱匿,超過70%的患者就診時已為晚期,預(yù)后差。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以鉑類和紫杉醇為主的化療是目前卵巢癌的一線治療方案,但是化療耐藥及腫瘤復(fù)發(fā)使傳統(tǒng)治療面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此,卵巢癌的分子靶向治療是近年來國內(nèi)外研究的熱點。目前分子靶向制劑大多是與腫瘤異常靶分子結(jié)合的單克隆抗體或小分子蛋白激酶抑制劑,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、抑制血管生成等,特異性高且毒性小。 PARP-1是存在于多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)、具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基(PAR)催化活性的蛋白酶,在DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、染色體功能、基因組穩(wěn)定和細(xì)胞死亡等方面均發(fā)揮重要作用。本課題前期研究表明,PARP-1在卵巢癌中的表達(dá)明顯上調(diào),應(yīng)用PARP-1抑制劑可增強(qiáng)卵巢癌耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性。Pyriochou等研究證實,PARP-1抑制劑PJ34可抑制雞胚尿囊膜實驗(CAM)的血管生成,有關(guān)PARP-1是否對卵巢癌的血管生成產(chǎn)生影響的報道較少。 本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法檢測PARP-1、VEGF-A. MVD在上皮性卵巢癌中的表達(dá),分析PARP-1與VEGF-A、MVD表達(dá)的相關(guān)性,并通過RNA干擾沉默SKOV3細(xì)胞的PARP-1基因,檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞VEGF-A的表達(dá)變化以及對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外成管能力的影響,探討PARP-1對卵巢癌血管生成、增殖的影響,從而為PARP-1的分子靶向治療提供理論依據(jù)。 方法 1.采用免疫組織化學(xué)方法檢測60例上皮性卵巢癌原發(fā)灶中PARP-1、VEGF-A、MVD的表達(dá)及30例正常卵巢對照組織中PARP-1的表達(dá),根據(jù)組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)將卵巢癌組織分為PARP-1陽性組、PARP-1陰性組。 2.RNA干擾沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞的PARP-1基因,將細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組(NC-siRNA組)、轉(zhuǎn)染PARP-1siRNA組(PARP1-siRNA組)。 3.體外成管實驗觀察沉默PARP-1對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外成管能力的影響。 4.MTT法檢測NC-siRNA組、PARP1-siRNA組細(xì)胞的增殖活性。 5.實時定量PCR (qRT-RCR)檢測PARP-1及VEGF-A mRNA表達(dá),蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞內(nèi)PARP-1及VEGF-A蛋白表達(dá)。ELISA法檢測細(xì)胞上清中VEGF-A的含量。 結(jié)果 1. PARP-1、VEGF-A、MVD在上皮性卵巢癌中的表達(dá)PARP-1陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核,卵巢癌組織中PARP-1陽性率為73.3%(44/60),正常卵巢對照組織中PARP-1陽性率為26.7%(8/30),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05). VEGF-A陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿,在所有檢測的卵巢癌標(biāo)本中全部表達(dá),評分位于1-6分,均值為(3.05±1.61)分。CD34標(biāo)記的MVD顯示,所有卵巢癌標(biāo)本的MVD均值為19.14±6.24。 2. PARP-1與卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系PARP-1在腫塊＜2cm組的陽性率顯著低于腫塊＞2cm組(P0.05),在高中分化組的陽性率顯著低于低分化組(P0.05),在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P0.05),而在不同臨床分期組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.上皮性卵巢癌中PARP-1與VEGF-A、MVD的相關(guān)性VEGF-A評分均值PARP-1陽性組(3.80±1.69)高于PARP-1陰性組(2.30±1.16),兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。MVD均值PARP-1陽性組(23.86±4.67)高于PARP-1陰性組(14.43±3.26),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 4.轉(zhuǎn)染效率檢測慢病毒載體中攜帶綠色熒光蛋白GFP,在倒置熒光顯微鏡下,成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)綠色熒光,轉(zhuǎn)染12h后可見熒光表達(dá),72h熒光強(qiáng)度最高,NC-siRNA組、PARP1-siRNA組的轉(zhuǎn)染效率分別為89%、86%。 5.RNA干擾對HUVEC體外成管的影響提取轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞的上清液分別培養(yǎng)HUVEC,結(jié)果顯示,體外成管數(shù)目NC-siRNA組(14.67±1.21)高于PARP1-siRNA組(8.83±1.47),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 6.RNA干擾對細(xì)胞增殖的影響MTT檢測結(jié)果表明,PARP1-siRNA組細(xì)胞增殖活性減弱,在48h、72h、96h,與NC-siRNA組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 7.RNA干擾對PARP-1mRNA及蛋白的抑制作用與NC-siRNA組相比,PARP1-siRNA組PARP-1mRNA的相對表達(dá)量明顯下降(P0.05),以actin為內(nèi)參照,NC-siRNA組、PARP1-siRNA組PARP-1蛋白表達(dá)量分別為0.93±0.22、0.38±0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。表明成功構(gòu)建了PARP-1基因沉默的細(xì)胞模型。 8.RNA干擾對VEGF-A mRNA及蛋白表達(dá)的影響PARP-1基因被沉默后,PARP1-siRNA組VEGF-A mRNA水平較NC-siRNA組明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,NC-siRNA組、PARP1-siRNA組VEGF-A蛋白表達(dá)量分別為：0.90±0.18、0.41±0.08,PARP1-siRNA組較NC-siRNA組表達(dá)下降(P0.05)。表明siRNA沉默PARP-1基因后,VEGF-A在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均下調(diào)。 9. ELASA檢測細(xì)胞上清中VEGF-A含量細(xì)胞上清中VEGF-A均值：NC-siRNA組(447.22±188.52) pg/mL高于PARP1-siRNA組(248.12±82.74)pg/mL(P0.05)。 結(jié)論 1. PARP-1通過上調(diào)VEGF-A的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的血管生成。 2.沉默PARP-1可抑制SKOV3細(xì)胞的增殖能力。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2472722