【摘要】：目的：宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率已超過結(jié)直腸癌，僅次于乳腺癌，且近年來有逐漸上升趨勢[1]。手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)治療未取得滿意成效。隨著RNA干擾技術(shù)發(fā)展，腫瘤的基因治療展現(xiàn)出美好前景。胰島素樣生長因子系統(tǒng)（IGFs）與腫瘤的關(guān)系也是近年研究的熱點，IGF-1R通過促進(jìn)正常細(xì)胞向惡性表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和分裂增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。我們前期研究表明RNAi沉默IGF-1R基因能明顯抑制基因IGF-1R的表達(dá)，從而促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡。高危型HPV16/18的E6基因是引起宮頸癌的主要致癌基因之一，有研究表明HPVE6-siRNA轉(zhuǎn)染HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞能夠降低細(xì)胞內(nèi)E6基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖[2-3]。然而人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因多步驟多因素的過程，單獨干擾某一個基因在腫瘤的基因治療進(jìn)程中存在局限性，因此利用RNAi技術(shù)同時抑制相關(guān)多個基因或同一個基因多個靶點已被受眾多研究者關(guān)注[4-5]。在此研究基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建了一個同時編碼IGF-1R和HPV18-E6兩個不同基因的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，并與干擾單個基因進(jìn)行比較，研究多基因共同沉默在腫瘤治療方面的作用，同時將RNA干擾與化療藥物順鉑聯(lián)合，觀察能否增強(qiáng)宮頸癌Hela對化療藥物順鉑的敏感性，探討提高宮頸癌治療效果的可能方法。 方法：1. shRNA質(zhì)粒構(gòu)建①根據(jù)IGF-1R、HPV18-E6的cDNA序列分別設(shè)計構(gòu)建IGF-1R shRNA重組質(zhì)粒pGenesil1.1-IGF-1R， HPV18-E6shRNA重組質(zhì)粒pGenesil1.2-HPV18-E6及陰性對照重組質(zhì)粒pGenesil1.1-HK。②利用分子亞克隆技術(shù)，，由IGF-1R、HPV18-E6重組質(zhì)粒構(gòu)建雙基因串聯(lián)的shRNA質(zhì)粒重組表達(dá)載體pGenesil1.1+2-(IGF-1R+HPV18-E6)。2.體外實驗研究①實驗分為五組：IGF-1R組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil1.1-IGF-1R；E6組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil1.2-HPV18-E6；IGF-1R+E6組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pGenesil1.1+2-(IGF-1R+HPV18-E6)；NC組，轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒pGenesil1.1-HK；Blank組，未轉(zhuǎn)染空白對照組，分別進(jìn)行體內(nèi)外實驗。②瞬時轉(zhuǎn)染24h、48h、72h時，RT-PCR測定各組IGF-1R和HPV18-E6mRNA表達(dá)。③Hoechst33258染色檢測瞬時轉(zhuǎn)染48h時各組細(xì)胞凋亡情況。④G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，RT-PCR測定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1R、HPV18-E6mRNA表達(dá)。⑤Western-blotting檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞IGF-1R和HPV18-E6蛋白表達(dá)。⑥MTT檢測各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力及對順鉑刺激的敏感性。3.體內(nèi)實驗研究①穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞接種BALB/c裸鼠，觀測各組成瘤時間、瘤體積和瘤重量的變化。②應(yīng)用免疫組化測定IGF-1R、HPV18-E6和CD34蛋白表達(dá)。③分別利用ELISA法檢測各組BALB/c裸鼠血清中宮頸癌腫瘤標(biāo)記物, SCC-Ag和TPS的含量，生化法檢測TSGF的含量。 結(jié)果：1.shRNA構(gòu)建成功①酶切和測序結(jié)果表明成功構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil1.1-IGF-1R、pGenesil1.2-HPV18-E6和pGenesil1.1-HK。②酶切鑒定結(jié)果顯示雙基因shRNA串聯(lián)質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil1.1+2-(IGF-1R+HPV18-E6)構(gòu)建成功；2.體外研究①各重組質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，瞬時轉(zhuǎn)染24h、48h、72h RT-PCR結(jié)果顯示：三個時間點單獨沉默或共沉默組均能有效抑制相應(yīng)基因mRNA表達(dá)，聯(lián)合沉默組在瞬時轉(zhuǎn)染48h對IGF-1R mRNA和HPV18-E6mRNA表達(dá)抑制率分別為63.01％和78.46％，均顯著高于轉(zhuǎn)染單基因shRNA的IGF-1R組和E6組（P0.05）。②Hoechest33258染色檢測，IGF-1R+E6組的凋亡率(32.81±1.07)%顯著高于IGF-1R組(21.65±0.34)%（P0.05）和E6組(19.73±1.62)%（P0.05）。③G418成功篩選各重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測各組轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%以上；RT-PCR顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1R+E6組對Hela細(xì)胞IGF-1R和HPV18-E6mRNA表達(dá)的抑制率分別為71.30%和78.52%。④Western-blotting檢測結(jié)果顯示IGF-1R+E6組對HPV18-E6蛋白和IGF-1R蛋白表達(dá)的抑制率分別為67.88%和81.14%，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。⑤MTT檢測提示：與IGF-1R和E6組比較，IGF-1R+E6組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖能力明顯抑制，對順鉑刺激的敏感性顯著提高（P0.05）。3.體內(nèi)研究①體內(nèi)實驗結(jié)果顯示IGF-1R+E6組移植瘤較單基因沉默組的平均瘤體積、重量明顯下降（P0.05）。②切片的免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實IGF-1R+E6組Hela細(xì)胞IGF-1R、HPV18-E6兩種蛋白及CD34表達(dá)均明顯下調(diào)。③ELISA法檢測結(jié)果顯示IGF-1R+E6組裸鼠血清中TPS表達(dá)明顯降低。 結(jié)論：shRNA串聯(lián)重組質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil1.1+2-(IGF-1R+HPV18-E6)轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞后，可同時降低IGF-1R和HPV18-E6mRNA與蛋白表達(dá)，比單獨沉默IGF-1R或HPV18-E6基因能較好地促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖和提高化療藥物的敏感性。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2463091