發(fā)布時間：2019-03-24 20:00

【摘要】：目的 宮頸癌的發(fā)生與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常有著密切關(guān)系，多種腫瘤的發(fā)生與MAPKs信號通路的激活有關(guān)。ERK通路作為MAPKs系統(tǒng)中最經(jīng)典的通路，，可通過一系列級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將細胞外信號傳導(dǎo)進入細胞核，激活核內(nèi)一系列效應(yīng)分子，調(diào)控細胞的增殖與凋亡等生物活動。c-Fos與c-Jun是核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可與多種與腫瘤發(fā)生、演進相關(guān)的啟動子或增強子基因結(jié)合，誘導(dǎo)癌基因的過度表達而引發(fā)癌變。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)ERK1/2、p-ERK、c-Fos與c-Jun蛋白的表達與活性異常，但有關(guān)ERK在宮頸癌中對c-Fos、c-Jun調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚。本次研究利用體外實驗的研究方法，揭示ERK對核轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、c-Jun表達的影響及其與宮頸癌細胞的關(guān)系，為宮頸癌病因和發(fā)病機制研究提供理論依據(jù)，為尋找新的干預(yù)靶點開拓思路。 方法 選擇宮頸癌細胞Hela（HPV18陽性）和C33A（HPV陰性）進行傳代培養(yǎng)，在采用CCK-8法篩選ERK抑制劑U0126半數(shù)致死濃度的基礎(chǔ)上，形成ERK抑制組和非抑制組（對照組）。對抑制前、后兩組宮頸癌細胞分別采用活細胞計數(shù)法和CCK-8法檢測各組宮頸癌細胞的生長情況和細胞活性；應(yīng)用流式細胞儀分析細胞的增殖、凋亡情況；采用Real-time PCR檢測ERK1/2、c-Fos和c-Jun mRNA的表達水平；應(yīng)用Western-blot法檢測ERK1/2、c-Fos和c-Jun蛋白表達情況。采用軟件SPSS17.0進行組間比較的t檢驗、F檢驗等統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果 1. Hela和C33A宮頸癌細胞一般生物學(xué)特性：①除24小時外，其余各時點兩種細胞數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；②Hela細胞細胞增殖指數(shù)（PI）高于C33A細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；③C33A細胞凋亡率高于Hela細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 2. Hela和C33A宮頸癌細胞ERK、c-Fos、c-Jun的表達：(1) Hela和C33A宮頸癌細胞ERK基因表達的比較：①Hela細胞ERK1mRNA相對表達為C33A細胞ERK1mRNA相對表達量的12%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；②C33A細胞非磷酸化ERK1/2蛋白表達水平為Hela細胞非磷酸化ERK1/2蛋白表達量的35%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。Hela和C33A細胞磷酸化ERK1/2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。(2) Hela和C33A宮頸癌細胞c-Fos基因表達的比較：①Hela細胞c-Fos mRNA相對表達量低于C33A細胞，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；②C33A細胞磷酸化c-Fos蛋白表達水平低于Hela細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。(3) Hela和C33A宮頸癌細胞c-Jun基因表達比較：①Hela細胞c-Jun mRNA相對表達量僅為C33A細胞c-Jun mRNA相對表達量的7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.001）；②Hela細胞非磷酸化c-Jun蛋白表達水平高于C33A細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；C33A細胞磷酸化c-Jun蛋白表達水平低于Hela細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 3. ERK對兩種宮頸癌細胞一般生物學(xué)特性的影響：（1）ERK對兩種宮頸癌細胞活性及細胞周期的影響：抑制劑組的活細胞數(shù)持續(xù)減少，兩種細胞各時間點ERK抑制后與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)；抑制后兩種宮頸癌細胞與對照組G1期相比較均增高，S期均降低（P0.001）；Hela細胞G1期比例數(shù)增高23.40%（P0.05），C33A細胞G1期比例數(shù)增高27.39%（P0.05）。抑制后C33A細胞與對照組G1期細胞比例上升量高于Hela細胞上升量（P0.05）；抑制后Hela細胞S期比例數(shù)增高24.72%（P0.05），C33A細胞S期的比例數(shù)增高25.20%（P0.05）。（2）ERK對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響：兩種宮頸癌細胞抑制組的增殖指數(shù)與對照組的增殖指數(shù)相比均降低(P0.001)，C33A細胞降低27.38%，Hela細胞降低23.40%，C33A降低量高于Hela細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；抑制后Hela與C33A細胞與對照組相比凋亡率都增加（P0.05），C33A細胞的凋亡率增加7.01%高于Hela細胞增加5.62%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 4. ERK對宮頸癌細胞ERK、c-Fos、c-Jun基因表達的影響：⑴ERK抑制前后ERK基因表達的比較：ERK抑制后的Hela細胞的ERK1與ERK2mRNA表達水平增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），而C33A細胞抑制后ERK1與ERK2mRNA表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），Hela細胞抑制后的ERK1與ERK2mRNA表達水平均高于C33A細胞，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；Hela與C33A兩種細胞ERK抑制后ERK蛋白表達均降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），而Hela與C33A兩種細胞ERK抑制后p-ERK蛋白表達水平也都有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。⑵ERK抑制前后c-Fos基因表達的比較：Hela細胞抑制后c-Fos基因mRNA的表達水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.001），C33A細胞抑制后的c-Fos mRNA的表達水平與對照組相比上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），ERK抑制后Hela細胞的c-Fos基因mRNA表達水平高于C33A細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.001）；ERK抑制對兩種細胞c-Fos蛋白表達水平的影響作用相似，C33A細胞ERK抑制后的磷酸化c-Fos蛋白表達量降低與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。⑶ERK抑制前后c-Jun基因表達的比較：ERK抑制后Hela細胞c-Jun基因mRNA表達水平升高，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.001），而C33A細胞c-Jun基因mRNA表達水平降低，無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），ERK抑制后Hela細胞的c-Jun基因mRNA表達水平高于C33A細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.001）；兩種細胞ERK抑制后的c-Jun蛋白表達水平均上升，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），Hela與C33A兩種宮頸癌細胞ERK抑制后與對照組c-Jun蛋白表達量的差值相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論 1. ERK具有促進宮頸癌細胞增殖、減少凋亡的作用。ERK抑制后宮頸癌細胞阻滯在G0/G1期，增殖指數(shù)下降，凋亡率上升。提示Hela與C33A細胞的增殖與ERK信號通路的激活有關(guān)，阻斷ERK信號通路可以減慢細胞周期G1/S期的進程。本研究通過ERK抑制后Hela較C33A細胞增殖指數(shù)高和凋亡率低結(jié)果進一步提示，HPV可能參與了ERK信號通路對宮頸癌細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)，有待深入探討。 2.兩種宮頸癌細胞的p-ERK的蛋白表達水平在ERK抑制后均降低，即ERK的抑制作用主要表現(xiàn)在ERK磷酸化的環(huán)節(jié)，而ERK的磷酸化對于激活細胞核內(nèi)致癌基因繼而促進細胞惡性轉(zhuǎn)化和進展非常重要。結(jié)合C33A和Hela細胞抑制后ERKmRNA表達水平也均降低，提示兩種宮頸癌細胞均可能通過轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)節(jié)對宮頸癌細胞的生物學(xué)特征發(fā)生影響，尤其是通過效應(yīng)蛋白表達的調(diào)節(jié)作用更為明顯。 3. ERK抑制后兩種細胞的c-Fos和c-Jun蛋白表達均降低，提示ERK可激活核轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和c-Jun效應(yīng)蛋白的生物活性，進而促進宮頸癌細胞的增殖、抑制其凋亡，再次提示ERK可作為宮頸癌生物治療的潛在靶點。ERK抑制后兩種細胞的c-Fos和c-Jun基因mRNA表達上升，提示在ERK信號通路調(diào)節(jié)過程中，可能有其他信號因子的參與，也可能與c-Fos和c-Jun蛋白水平降低激發(fā)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，其詳細機制有待深入探討。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

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