【摘要】：人乳頭瘤病毒HPV (human papillomaviruses)感染是導致宮頸癌發(fā)生的首要危險因素。根據(jù)人乳頭瘤HPV病毒對生殖系統(tǒng)的致癌危險性將其劃分為“高危型”和低危型”,高危型HPV病毒有HPV 16、18、31、33、51等十余型,常常引起細胞惡性轉(zhuǎn)化。HPV 16亞型主要引發(fā)鱗癌,HPV18亞型主要引發(fā)腺癌。我國患宮頸癌的比率是15/10萬/年,僅次于發(fā)病第一的國家-智利。目前我國宮頸癌的死亡率是11.34%,居女性癌癥死亡率第二位,特別是在西部地區(qū),宮頸癌死亡率位于女性癌癥死亡率之首,因此我國將宮頸癌列為癌癥防治重點之一。流行病學調(diào)查結(jié)果顯示高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是導致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的首要啟動因子。目前雖然預防性的HPV疫苗已經(jīng)研究成功并上市(包括二價疫苗,四價疫苗,九價疫苗),但這些疫苗最多只能預防9種HPV亞型的感染,并不能涵蓋所有HPV的高危亞型,而且對已經(jīng)感染HPV病毒或者患有免疫缺陷抑制疾病的病人無效。由于目前并未闡明高危型HPV病毒的致病機理,因此臨床尚未研究出針對HPV病毒的特異性藥物。HPV病毒屬于小環(huán)狀病毒,高危型HPV病毒主要是借助E6和E7蛋白來發(fā)揮其致癌性,E6和E7蛋白分別與腫瘤抑制基因p53和pRb結(jié)合并導致其失活,引起宮頸組織細胞的生長失控和惡性轉(zhuǎn)化,從而誘導宮頸組織癌變。但是我們對E7蛋白的了解仍不充分,比如E7如何誘導細胞越過G1檢驗期進入S期,一直不十分清楚。細胞周期能夠有條不紊地進行,主要在于細胞內(nèi)存在監(jiān)控機制即細胞周期檢驗點(cell cycle checkpoints)。細胞周期檢驗點一旦發(fā)生異常,就會導致基因組發(fā)生不穩(wěn)定,目前基因組不穩(wěn)定已被認定為癌癥進展的一個重要標志。多倍體(即細胞擁有兩套以上的染色體)作為基因組不穩(wěn)定的表現(xiàn)形式之一,已被公認為腫瘤發(fā)生的重要誘因。有意義的是,在宮頸癌的發(fā)生早期可以檢測到多倍體細胞的存在。多倍體的形成原因之一為DNA重復復制(re-replication),即在一個細胞周期內(nèi)復制啟動一次以上或者多次連續(xù)的S期復制卻沒有進行有絲分裂。我們最近研究發(fā)現(xiàn),HPV-16 E7能夠誘導細胞發(fā)生重復復制,高危型HPV-16 E7可以通過上調(diào)DNA復制因子Cdt1誘導原代角質(zhì)化上皮細胞(PHKs)在G2期進行重復復制,從而導致多倍體細胞的形成。除此之外,我們對E7如何誘導DNA重復復制知之甚少。正常細胞里的基因組DNA在每一輪細胞周期內(nèi)只會復制一次。復制起始分為兩步：復制前復合體(pre-RC)的組裝和激活。復制前復合體的組裝過程受到細胞周期的調(diào)控,該過程主要發(fā)生在有絲分裂的晚期以及G1期。MCM2-7在DNA復制起始及延長(通過解開DNA雙螺旋)中均發(fā)揮重要作用。在真核細胞復制開始后,這些起始蛋白會被降解或被抑制從而使細胞不能發(fā)生重復復制。細胞通過采用一些檢驗許可點來監(jiān)測是否有足夠的復制起始因子來啟動復制從而防止細胞提前進入S期。G1檢驗點之所以能夠決定細胞能否進入S期進而開始DNA復制,主要是因為在G1早期Cdk4-Cdk6對pRb的部分磷酸化及在G1晚期Cdk2對pRb的完全磷酸化的調(diào)控。我們的前期研究結(jié)果顯示表達高危型HPV E7的細胞在DNA損傷及血清饑餓條件下可以逃避G1檢驗點的監(jiān)控,這些結(jié)果與有關文獻報道一致。但是對于E7如何調(diào)控細胞周期G1檢驗點的機制目前尚不十分清楚。第一部分WDHD1在人乳頭瘤病毒HPV E7誘發(fā)的腫瘤形成中的作用用一種永生化的角質(zhì)化細胞Spontaneously immortalized human foreskin keratinocytes (NIKS),我們利用RNA-seq技術將E7表達細胞與對照細胞全基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組進行了測序與分析。共發(fā)現(xiàn)有237個基因在E7表達細胞與對照細胞之間存在明顯表達差異,其中150個基因在E7表達細胞中表達上調(diào),87個基因在E7表達細胞中表達下調(diào)。為了驗證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性,我們基于E7相關的生物學功能選擇了12個基因分別在NIKS(包含E7表達細胞以及對照細胞)和原代角質(zhì)化細胞PHKs(包含E7表達細胞以及對照細胞)細胞中進行實時定量PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因與RNA-seq分析結(jié)果一致,而且E7表達細胞與對照細胞之間的差異具有明顯統(tǒng)計學意義。接下來我們對E7表達細胞中具有差異表達的237種基因進行生物信息學的分析,通過GO(Gene Ontology)注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫聚類分析發(fā)現(xiàn)與DNA復制、DNA修復以及核苷酸代謝等促進細胞周期進展的信號通路在E7表達細胞中明顯上調(diào),而參與程序性細胞死亡以及分解代謝調(diào)節(jié)的信號通路在E7表達細胞中明顯下調(diào)�？紤]到與細胞周期和DNA復制通路相關的基因在E7表達細胞中明顯失調(diào),我們選擇了參與DNA復制和G1檢驗點調(diào)節(jié)的WDHD1進行了進一步研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)WDHD1的mRNA及蛋白水平在E7表達細胞中均升高,而低危型E7(6E7)并不能使WDHD1 mRNA及蛋白水平升高。我們同時也發(fā)現(xiàn)WDHD1在E7表達細胞中的半衰期比對照細胞明顯延長。為了檢測WDHD1在E7表達細胞中能否發(fā)揮其細胞周期調(diào)控的作用,我們首先加入博來霉素使對照細胞不能越過G1檢驗點的情況下,E7細胞仍然能夠越過G1檢驗點,接著分別轉(zhuǎn)入WDHD1的兩個小干擾序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著WDHD1的敲除,細胞發(fā)生G1期阻滯。這表明WDH D1蛋白通參與調(diào)控E7細胞G1檢測點。值得注意的是,當E7表達細胞部分敲除WDHD1達到和對照細胞表達量相同時,也就是不影響細胞的正常DNA復制時,該細胞仍然停滯G1期。這表明WDHD1蛋白是通過一種非依賴與DNA復制起始的機制,進一步調(diào)控E7細胞G1檢測點。為了更直接驗證WDHD1促進細胞進入S期的功能,我們采取了BrdU的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在E7表達細胞中當敲除WDHD1后BrdU的插入量明顯減少。這些均表明在HPV E7表達細胞中WDHD1在細胞周期G1期調(diào)控以及S期的進入過程均發(fā)揮著重要作用。我們最近研究表明,HPV-16 E7表達細胞在DNA損傷情況下會發(fā)生重復復制,并且DNA復制的啟動因素Cdt1在此過程中扮演著重要的角色。既然WDHD1被認為是DNA復制起始因子,那么它是否影響E7細胞的重復復制呢?首先我們將E7表達細胞同步化在G1期,然后進行不同時間點的釋放,發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長細胞發(fā)生了重復復制。當敲除WDHD1后發(fā)現(xiàn)細胞的重復復制是明顯降低的。那么在E7表達細胞中WDHD1是如何調(diào)控重復復制的呢?已知DNA復制起始因子招募MCM家族成員到復制起始區(qū)域從而啟動DNA復制,WDHD1的HMG box也具有與DNA結(jié)合的特性,因此WDHD1是否會通過MCM家族的成員來調(diào)控DNA復制呢?結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)MCM3結(jié)合到E7表達細胞啟動子區(qū)域的量要高于對照細胞,而當敲除WDHD1后MCM3結(jié)合到啟動子區(qū)域的量是下降的,同時WDHD1也能夠影響MCM3的mRNA及蛋白水平。當敲除MCM3后細胞的重復復制也是明顯降低的。綜上所述,WDHD1蛋白能夠調(diào)控E7細胞的G1檢驗點及DNA復制和重復復制,這些過程主要是依賴與WDH D1調(diào)控MCM3來完成的。第二部分WDHD1在HPV誘發(fā)的腫瘤及其他腫瘤中的調(diào)節(jié)機制人類的多種疾病包括癌癥、自身免疫系統(tǒng)疾病以及炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展都有細胞信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)的參與。STATs家族成員含有多個保守結(jié)構域和功能性結(jié)構域,其中最為保守的結(jié)構域是SH2結(jié)構域。當細胞受到刺激時,STAT3作為轉(zhuǎn)錄因子其SH2結(jié)構域與受體上被磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合,同時STAT3自身發(fā)生磷酸化。STAT3在細胞內(nèi)起著重要的信號傳遞作用,主要負責將細胞外的信號傳遞到細胞核內(nèi),進一步與靶基因啟動子結(jié)合從而誘導靶基因轉(zhuǎn)錄。目前許多STAT3的靶基因已被確定,包含編碼抗凋亡蛋白的Bcl-2、Bcl-X和Mcl-1,增值相關蛋白Myc和Cyclin D1,以及促血管生成因子VEGF等。通過對RNA-seq數(shù)據(jù)進行生物信息學分析,我們發(fā)現(xiàn)STAT3在E7細胞的基因表達調(diào)控中發(fā)揮著舉足輕重的作用。首先STAT3和WDHD1的mRNA水平在E7細胞中均是升高的,另外我們發(fā)現(xiàn)WDH D1啟動子區(qū)域有3個STAT3的結(jié)合位點。那么STAT3是否具有WDHD1調(diào)控細胞DNA復制的功能以及是否能調(diào)控WDHD1呢?以下的所有數(shù)據(jù)在E7表達細胞、腸癌細胞和乳腺癌細胞等多種細胞中均得到了驗證,篇幅所限,我們將展示腸癌和乳腺癌細胞的結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細胞中,敲除STAT3后細胞DNA復制減少,而將STAT3過表達后細胞的DNA復制會增多,說明STAT3在DNA復制過程中起作用。MLN4924可以誘導腸癌細胞HCT116發(fā)生重復復制,當敲除STAT3后細胞重復復制明顯減少,提示STAT3在重復復制過程中也發(fā)揮作用。當用STAT3的激活因子IL-6以及EGF處理后發(fā)現(xiàn)WDHD1的mRNA也是增多的。既然STAT3不僅具有影響DNA復制和重復復制的功能,而且影響WDHD1的mRNA以及蛋白水平,那么STAT3是如何調(diào)控WDHD1的呢?STAT家族識別的經(jīng)典DNA結(jié)合序列是TTCC(C or G)GGAA(或TTN5AA),且我們發(fā)現(xiàn)WDHD1啟動子區(qū)域有3個STAT3的結(jié)合位點。我們通過實驗證明STAT3確實能夠通過結(jié)合該3個位點來啟動WDHD1的轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果說明,STAT3能夠調(diào)控WDHD1,當STAT3表達下降時細胞的DNA復制及重復復制均減少。那么在STAT3表達下降的前提下再高表達WDHD1(使WDHD1表達量恢復到原水平),下降的DNA復制和重復復制會恢復嗎?結(jié)果發(fā)現(xiàn)由STAT3的減少引起的細胞DNA復制和重復復制在WDHD1重新高表達的情況下又恢復了。綜上所述,STAT3可以通過與WDHD1啟動子區(qū)域的結(jié)合位點結(jié)合從而促進WDHD1基因轉(zhuǎn)錄,WDHD1通過影響MCM3進而影響細胞DNA復制和重復復制。我們的研究闡明了高危型HPV誘發(fā)腫瘤發(fā)生的機制,同時也為臨床尋找新的治療宮頸癌以及其他腫瘤的策略提供理論支持。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 Tadashi Matsuda;Ryuta Muromoto;Yuichi Sekine;Sumihito Togi;Yuichi Kitai;Shigeyuki Kon;Kenji Oritani;;Signal transducer and activator of transcription 3 regulation by novel binding partners[J];World Journal of Biological Chemistry;2015年04期

，

本文編號：2404373