【摘要】：人乳頭瘤病毒HPV (human papillomaviruses)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的首要危險(xiǎn)因素。根據(jù)人乳頭瘤HPV病毒對(duì)生殖系統(tǒng)的致癌危險(xiǎn)性將其劃分為“高危型”和低危型”,高危型HPV病毒有HPV 16、18、31、33、51等十余型,常常引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。HPV 16亞型主要引發(fā)鱗癌,HPV18亞型主要引發(fā)腺癌。我國(guó)患宮頸癌的比率是15/10萬(wàn)/年,僅次于發(fā)病第一的國(guó)家-智利。目前我國(guó)宮頸癌的死亡率是11.34%,居女性癌癥死亡率第二位,特別是在西部地區(qū),宮頸癌死亡率位于女性癌癥死亡率之首,因此我國(guó)將宮頸癌列為癌癥防治重點(diǎn)之一。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的首要啟動(dòng)因子。目前雖然預(yù)防性的HPV疫苗已經(jīng)研究成功并上市(包括二價(jià)疫苗,四價(jià)疫苗,九價(jià)疫苗),但這些疫苗最多只能預(yù)防9種HPV亞型的感染,并不能涵蓋所有HPV的高危亞型,而且對(duì)已經(jīng)感染HPV病毒或者患有免疫缺陷抑制疾病的病人無(wú)效。由于目前并未闡明高危型HPV病毒的致病機(jī)理,因此臨床尚未研究出針對(duì)HPV病毒的特異性藥物。HPV病毒屬于小環(huán)狀病毒,高危型HPV病毒主要是借助E6和E7蛋白來(lái)發(fā)揮其致癌性,E6和E7蛋白分別與腫瘤抑制基因p53和pRb結(jié)合并導(dǎo)致其失活,引起宮頸組織細(xì)胞的生長(zhǎng)失控和惡性轉(zhuǎn)化,從而誘導(dǎo)宮頸組織癌變。但是我們對(duì)E7蛋白的了解仍不充分,比如E7如何誘導(dǎo)細(xì)胞越過(guò)G1檢驗(yàn)期進(jìn)入S期,一直不十分清楚。細(xì)胞周期能夠有條不紊地進(jìn)行,主要在于細(xì)胞內(nèi)存在監(jiān)控機(jī)制即細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)(cell cycle checkpoints)。細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)一旦發(fā)生異常,就會(huì)導(dǎo)致基因組發(fā)生不穩(wěn)定,目前基因組不穩(wěn)定已被認(rèn)定為癌癥進(jìn)展的一個(gè)重要標(biāo)志。多倍體(即細(xì)胞擁有兩套以上的染色體)作為基因組不穩(wěn)定的表現(xiàn)形式之一,已被公認(rèn)為腫瘤發(fā)生的重要誘因。有意義的是,在宮頸癌的發(fā)生早期可以檢測(cè)到多倍體細(xì)胞的存在。多倍體的形成原因之一為DNA重復(fù)復(fù)制(re-replication),即在一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)復(fù)制啟動(dòng)一次以上或者多次連續(xù)的S期復(fù)制卻沒(méi)有進(jìn)行有絲分裂。我們最近研究發(fā)現(xiàn),HPV-16 E7能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生重復(fù)復(fù)制,高危型HPV-16 E7可以通過(guò)上調(diào)DNA復(fù)制因子Cdt1誘導(dǎo)原代角質(zhì)化上皮細(xì)胞(PHKs)在G2期進(jìn)行重復(fù)復(fù)制,從而導(dǎo)致多倍體細(xì)胞的形成。除此之外,我們對(duì)E7如何誘導(dǎo)DNA重復(fù)復(fù)制知之甚少。正常細(xì)胞里的基因組DNA在每一輪細(xì)胞周期內(nèi)只會(huì)復(fù)制一次。復(fù)制起始分為兩步：復(fù)制前復(fù)合體(pre-RC)的組裝和激活。復(fù)制前復(fù)合體的組裝過(guò)程受到細(xì)胞周期的調(diào)控,該過(guò)程主要發(fā)生在有絲分裂的晚期以及G1期。MCM2-7在DNA復(fù)制起始及延長(zhǎng)(通過(guò)解開DNA雙螺旋)中均發(fā)揮重要作用。在真核細(xì)胞復(fù)制開始后,這些起始蛋白會(huì)被降解或被抑制從而使細(xì)胞不能發(fā)生重復(fù)復(fù)制。細(xì)胞通過(guò)采用一些檢驗(yàn)許可點(diǎn)來(lái)監(jiān)測(cè)是否有足夠的復(fù)制起始因子來(lái)啟動(dòng)復(fù)制從而防止細(xì)胞提前進(jìn)入S期。G1檢驗(yàn)點(diǎn)之所以能夠決定細(xì)胞能否進(jìn)入S期進(jìn)而開始DNA復(fù)制,主要是因?yàn)樵贕1早期Cdk4-Cdk6對(duì)pRb的部分磷酸化及在G1晚期Cdk2對(duì)pRb的完全磷酸化的調(diào)控。我們的前期研究結(jié)果顯示表達(dá)高危型HPV E7的細(xì)胞在DNA損傷及血清饑餓條件下可以逃避G1檢驗(yàn)點(diǎn)的監(jiān)控,這些結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。但是對(duì)于E7如何調(diào)控細(xì)胞周期G1檢驗(yàn)點(diǎn)的機(jī)制目前尚不十分清楚。第一部分WDHD1在人乳頭瘤病毒HPV E7誘發(fā)的腫瘤形成中的作用用一種永生化的角質(zhì)化細(xì)胞Spontaneously immortalized human foreskin keratinocytes (NIKS),我們利用RNA-seq技術(shù)將E7表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞全基因組范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序與分析。共發(fā)現(xiàn)有237個(gè)基因在E7表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞之間存在明顯表達(dá)差異,其中150個(gè)基因在E7表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),87個(gè)基因在E7表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性,我們基于E7相關(guān)的生物學(xué)功能選擇了12個(gè)基因分別在NIKS(包含E7表達(dá)細(xì)胞以及對(duì)照細(xì)胞)和原代角質(zhì)化細(xì)胞PHKs(包含E7表達(dá)細(xì)胞以及對(duì)照細(xì)胞)細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因與RNA-seq分析結(jié)果一致,而且E7表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞之間的差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接下來(lái)我們對(duì)E7表達(dá)細(xì)胞中具有差異表達(dá)的237種基因進(jìn)行生物信息學(xué)的分析,通過(guò)GO(Gene Ontology)注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)聚類分析發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、DNA修復(fù)以及核苷酸代謝等促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展的信號(hào)通路在E7表達(dá)細(xì)胞中明顯上調(diào),而參與程序性細(xì)胞死亡以及分解代謝調(diào)節(jié)的信號(hào)通路在E7表達(dá)細(xì)胞中明顯下調(diào)�？紤]到與細(xì)胞周期和DNA復(fù)制通路相關(guān)的基因在E7表達(dá)細(xì)胞中明顯失調(diào),我們選擇了參與DNA復(fù)制和G1檢驗(yàn)點(diǎn)調(diào)節(jié)的WDHD1進(jìn)行了進(jìn)一步研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)WDHD1的mRNA及蛋白水平在E7表達(dá)細(xì)胞中均升高,而低危型E7(6E7)并不能使WDHD1 mRNA及蛋白水平升高。我們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)WDHD1在E7表達(dá)細(xì)胞中的半衰期比對(duì)照細(xì)胞明顯延長(zhǎng)。為了檢測(cè)WDHD1在E7表達(dá)細(xì)胞中能否發(fā)揮其細(xì)胞周期調(diào)控的作用,我們首先加入博來(lái)霉素使對(duì)照細(xì)胞不能越過(guò)G1檢驗(yàn)點(diǎn)的情況下,E7細(xì)胞仍然能夠越過(guò)G1檢驗(yàn)點(diǎn),接著分別轉(zhuǎn)入WDHD1的兩個(gè)小干擾序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著WDHD1的敲除,細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。這表明WDH D1蛋白通參與調(diào)控E7細(xì)胞G1檢測(cè)點(diǎn)。值得注意的是,當(dāng)E7表達(dá)細(xì)胞部分敲除WDHD1達(dá)到和對(duì)照細(xì)胞表達(dá)量相同時(shí),也就是不影響細(xì)胞的正常DNA復(fù)制時(shí),該細(xì)胞仍然停滯G1期。這表明WDHD1蛋白是通過(guò)一種非依賴與DNA復(fù)制起始的機(jī)制,進(jìn)一步調(diào)控E7細(xì)胞G1檢測(cè)點(diǎn)。為了更直接驗(yàn)證WDHD1促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期的功能,我們采取了BrdU的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在E7表達(dá)細(xì)胞中當(dāng)敲除WDHD1后BrdU的插入量明顯減少。這些均表明在HPV E7表達(dá)細(xì)胞中WDHD1在細(xì)胞周期G1期調(diào)控以及S期的進(jìn)入過(guò)程均發(fā)揮著重要作用。我們最近研究表明,HPV-16 E7表達(dá)細(xì)胞在DNA損傷情況下會(huì)發(fā)生重復(fù)復(fù)制,并且DNA復(fù)制的啟動(dòng)因素Cdt1在此過(guò)程中扮演著重要的角色。既然WDHD1被認(rèn)為是DNA復(fù)制起始因子,那么它是否影響E7細(xì)胞的重復(fù)復(fù)制呢?首先我們將E7表達(dá)細(xì)胞同步化在G1期,然后進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的釋放,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞發(fā)生了重復(fù)復(fù)制。當(dāng)敲除WDHD1后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的重復(fù)復(fù)制是明顯降低的。那么在E7表達(dá)細(xì)胞中WDHD1是如何調(diào)控重復(fù)復(fù)制的呢?已知DNA復(fù)制起始因子招募MCM家族成員到復(fù)制起始區(qū)域從而啟動(dòng)DNA復(fù)制,WDHD1的HMG box也具有與DNA結(jié)合的特性,因此WDHD1是否會(huì)通過(guò)MCM家族的成員來(lái)調(diào)控DNA復(fù)制呢?結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)MCM3結(jié)合到E7表達(dá)細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)域的量要高于對(duì)照細(xì)胞,而當(dāng)敲除WDHD1后MCM3結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域的量是下降的,同時(shí)WDHD1也能夠影響MCM3的mRNA及蛋白水平。當(dāng)敲除MCM3后細(xì)胞的重復(fù)復(fù)制也是明顯降低的。綜上所述,WDHD1蛋白能夠調(diào)控E7細(xì)胞的G1檢驗(yàn)點(diǎn)及DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制,這些過(guò)程主要是依賴與WDH D1調(diào)控MCM3來(lái)完成的。第二部分WDHD1在HPV誘發(fā)的腫瘤及其他腫瘤中的調(diào)節(jié)機(jī)制人類的多種疾病包括癌癥、自身免疫系統(tǒng)疾病以及炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展都有細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)的參與。STATs家族成員含有多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和功能性結(jié)構(gòu)域,其中最為保守的結(jié)構(gòu)域是SH2結(jié)構(gòu)域。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí),STAT3作為轉(zhuǎn)錄因子其SH2結(jié)構(gòu)域與受體上被磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合,同時(shí)STAT3自身發(fā)生磷酸化。STAT3在細(xì)胞內(nèi)起著重要的信號(hào)傳遞作用,主要負(fù)責(zé)將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi),進(jìn)一步與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合從而誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。目前許多STAT3的靶基因已被確定,包含編碼抗凋亡蛋白的Bcl-2、Bcl-X和Mcl-1,增值相關(guān)蛋白Myc和Cyclin D1,以及促血管生成因子VEGF等。通過(guò)對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)STAT3在E7細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著舉足輕重的作用。首先STAT3和WDHD1的mRNA水平在E7細(xì)胞中均是升高的,另外我們發(fā)現(xiàn)WDH D1啟動(dòng)子區(qū)域有3個(gè)STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。那么STAT3是否具有WDHD1調(diào)控細(xì)胞DNA復(fù)制的功能以及是否能調(diào)控WDHD1呢?以下的所有數(shù)據(jù)在E7表達(dá)細(xì)胞、腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞等多種細(xì)胞中均得到了驗(yàn)證,篇幅所限,我們將展示腸癌和乳腺癌細(xì)胞的結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中,敲除STAT3后細(xì)胞DNA復(fù)制減少,而將STAT3過(guò)表達(dá)后細(xì)胞的DNA復(fù)制會(huì)增多,說(shuō)明STAT3在DNA復(fù)制過(guò)程中起作用。MLN4924可以誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞HCT116發(fā)生重復(fù)復(fù)制,當(dāng)敲除STAT3后細(xì)胞重復(fù)復(fù)制明顯減少,提示STAT3在重復(fù)復(fù)制過(guò)程中也發(fā)揮作用。當(dāng)用STAT3的激活因子IL-6以及EGF處理后發(fā)現(xiàn)WDHD1的mRNA也是增多的。既然STAT3不僅具有影響DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制的功能,而且影響WDHD1的mRNA以及蛋白水平,那么STAT3是如何調(diào)控WDHD1的呢?STAT家族識(shí)別的經(jīng)典DNA結(jié)合序列是TTCC(C or G)GGAA(或TTN5AA),且我們發(fā)現(xiàn)WDHD1啟動(dòng)子區(qū)域有3個(gè)STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明STAT3確實(shí)能夠通過(guò)結(jié)合該3個(gè)位點(diǎn)來(lái)啟動(dòng)WDHD1的轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果說(shuō)明,STAT3能夠調(diào)控WDHD1,當(dāng)STAT3表達(dá)下降時(shí)細(xì)胞的DNA復(fù)制及重復(fù)復(fù)制均減少。那么在STAT3表達(dá)下降的前提下再高表達(dá)WDHD1(使WDHD1表達(dá)量恢復(fù)到原水平),下降的DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制會(huì)恢復(fù)嗎?結(jié)果發(fā)現(xiàn)由STAT3的減少引起的細(xì)胞DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制在WDHD1重新高表達(dá)的情況下又恢復(fù)了。綜上所述,STAT3可以通過(guò)與WDHD1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合從而促進(jìn)WDHD1基因轉(zhuǎn)錄,WDHD1通過(guò)影響MCM3進(jìn)而影響細(xì)胞DNA復(fù)制和重復(fù)復(fù)制。我們的研究闡明了高危型HPV誘發(fā)腫瘤發(fā)生的機(jī)制,同時(shí)也為臨床尋找新的治療宮頸癌以及其他腫瘤的策略提供理論支持。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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1 Tadashi Matsuda;Ryuta Muromoto;Yuichi Sekine;Sumihito Togi;Yuichi Kitai;Shigeyuki Kon;Kenji Oritani;;Signal transducer and activator of transcription 3 regulation by novel binding partners[J];World Journal of Biological Chemistry;2015年04期

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本文編號(hào)：2404373