發(fā)布時(shí)間：2019-01-04 14:05

【摘要】：第一部分Maspin基因在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的研究目的研究正常及缺氧環(huán)境下maspin基因在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株中的表達(dá)情況。方法利用化學(xué)物質(zhì)二氯化鈷(Cobalt(Ⅱ) chloride, CoCl2)構(gòu)建細(xì)胞缺氧環(huán)境,依次采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)和巢式PCR (Nest-PCR)的方法檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株中maspin的mRNA表達(dá)情況,并采用蛋白印跡法(Western Blotting)檢測(cè)正常及缺氧環(huán)境下maspin的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1.RT-PCR的結(jié)果顯示,正常及缺氧條件下,maspin mRNA有微量表達(dá)。2.巢式PCR及瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示,在196bp處見(jiàn)到明顯的條帶,提示正常及缺氧條件下,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中有微量mRNA的表達(dá)。3. Western blotting結(jié)果顯示,正常及缺氧環(huán)境下,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株中均未見(jiàn)到明顯的maspin蛋白條帶。結(jié)論無(wú)論在正�；蛉毖鯒l件下,我們只能發(fā)現(xiàn)maspin在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株微量的mRNA表達(dá),但無(wú)法檢測(cè)到maspin蛋白的表達(dá)。我們認(rèn)為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株中幾乎沒(méi)有maspin基因的表達(dá)。第二部分外源性重組人maspin蛋白對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響目的研究正常及缺氧環(huán)境下外源性重組人maspin蛋白對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。方法分別在正常及缺氧環(huán)境下,使用3種不同濃度的重組人maspin蛋白(r-maspin)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。分別使用CCK8試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、劃痕實(shí)驗(yàn)、小管形成實(shí)驗(yàn)及一氧化氮(NO)試劑盒檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、管形成及一氧化氮的合成。結(jié)果1.正常氧環(huán)境下,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保持72小時(shí)持續(xù)增殖的趨勢(shì)。然而,缺氧環(huán)境下,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受到顯著抑制。正常氧環(huán)境下,r-maspin明顯促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,在處理的48小時(shí)后,促增殖的趨勢(shì)達(dá)到高峰；低氧環(huán)境下,僅高濃度r-maspin可明顯促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。2.與正常氧環(huán)境相比,缺氧環(huán)境下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯變化。正常氧環(huán)境及缺氧環(huán)境下,r-maspin對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞均無(wú)明顯的促凋亡作用。3.正常氧環(huán)境下,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞間劃痕的寬度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變窄;而缺氧環(huán)境下,劃痕的寬度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)未發(fā)生明顯變化,提示缺氧明顯抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。正常及缺氧環(huán)境下,r-maspin處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞間劃痕的寬度均未發(fā)生明顯改變,提示臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生明顯的遷移。4.管形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比,缺氧環(huán)境下,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞明顯聚集成團(tuán),形成的管腔直徑較小,但管腔數(shù)量幾乎是正常對(duì)照組的3倍。正常環(huán)境下,不同濃度r-maspin處理后,HUVECs形成的管腔直徑較對(duì)照組縮窄了50%,管腔數(shù)量增加2倍。缺氧環(huán)境下,r-masp in也能夠明顯抑制HUVECs的管形成。高濃度r-maspin處理后,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不能形成完整的管腔,僅能形成不完整的管腔分支。5.與正常對(duì)照組相比,缺氧環(huán)境下臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)合成的一氧化氮減少了50%(84.84±12.32 vs.171.3±6.332,P0.01)。正常環(huán)境下,r-maspin處理后,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)合成的一氧化氮顯著的減少。缺氧環(huán)境下,r-maspin也可使一氧化氮的合成明顯的減少,但是,差異沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論R-maspin蛋白明顯促進(jìn)HUVECs的增殖,同時(shí)抑制H UVECs的一氧化氮的合成和管形成能力,導(dǎo)致增多的狹窄管腔的形成,但是對(duì)HUVEC s的凋亡和遷移能力無(wú)明顯影響。這些結(jié)果證明外源性重組人maspin蛋白調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能。第三部分Maspin調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的分子機(jī)制研究目的探討maspin調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的分子機(jī)制。方法分別在正常及缺氧環(huán)境下,使用3種不同濃度的重組人maspin蛋白(r-maspin)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)及蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)MMP2的mRNA及蛋白表達(dá)情況,采用明膠酶譜法檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)MMP2的活性。結(jié)果1.與正常對(duì)照組相比,缺氧環(huán)境下MMP2的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯改變；正常氧環(huán)境下,MMP2的蛋白表達(dá)水平隨著r-maspin濃度的升高而升高,高濃度r-maspin顯著促進(jìn)MMP2的蛋白表達(dá)；與之相反,缺氧環(huán)境下,MMP2的蛋白表達(dá)水平隨著r-maspin濃度的升高而降低,高濃度r-maspin顯著抑制MMP2的蛋白表達(dá)。2.明膠酶譜的結(jié)果顯示：正常氧環(huán)境下,活性的MMP2 (63-KD)和MMP2的前體形式(72-KD)均有表達(dá);而缺氧環(huán)境下,只能檢測(cè)到MMP2的前體形式(72-KD)。正常氧環(huán)境下,高濃度r-maspin存在時(shí)只有72-KD形式的MMP2存在。結(jié)論無(wú)論正常氧環(huán)境或缺氧環(huán)境下,r-maspin均不影響MMP2的mRNA表達(dá)。高濃度r-maspin在正常氧環(huán)境下明顯促進(jìn)MMP2的蛋白表達(dá),而在缺氧環(huán)境下明顯抑制MMP2的蛋白表達(dá)。正常氧環(huán)境下,r-maspin抑制MMP2的活性,缺氧可直接抑制MMP2的活性。這些結(jié)果說(shuō)明maspin可通過(guò)改變MMP2的表達(dá)和活性而影響臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R714.244

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本文編號(hào)：2400387