【摘要】：盆底局部肌組織再生能力障礙是女性壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)發(fā)生的重要原因。除了傳統(tǒng)的手術(shù)和藥物治療以外,干細胞移植是目前行之有效且具有廣闊前景的一種SUI治療方法。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是組織工程(Tissue Engineering)重要的種子細胞。BMSCs移植到SUI患者的尿道周圍組織后,可通過替代、修復受損的尿道括約肌,增強尿道括約肌張力,改善尿控功能,有望從根本上治療SUI。干細胞移植入體內(nèi)后向靶組織和器官的募集情況,是整個干細胞治療成功與否的基礎(chǔ),直接關(guān)系到其治療效果,因而一直是組織工程領(lǐng)域備受關(guān)注的問題。目前干細胞移植普遍存在著歸巢率低、療效欠佳的現(xiàn)狀,如何人為地有效引導干細胞向靶組織募集,提高干細胞的歸巢率,是當下急需解決的問題之一。 基質(zhì)細胞衍生因子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)及其受體CXCR4所構(gòu)成的SDF-1/CXCR4軸在干細胞歸巢的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。CXCR4廣泛表達于多種組織細胞,在BMSCs亦有表達。SDF-1可誘導CXCR4+細胞從低濃度向高濃度趨化遷移。基于細胞的這種趨化特性,我們可以通過調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4軸的表達,間接對這種趨化作用的強弱進行人為調(diào)控。已有研究證實雌激素可以上調(diào)SDF-1/CXCR4軸的表達,提示雌激素干預可作為調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4表達的手段,進而調(diào)控BMSCs的趨化遷移。 本研究以3周齡的雌性SD大鼠為材料,全骨髓+貼壁法分離并培養(yǎng)BMSCs,以不同濃度的17p-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)分別干預BMSCs,檢測其CXCR4基因和蛋白的表達變化,從中選擇可誘導BMSCs獲得最高表達CXCR4的E2濃度,觀察該濃度E2干預的BMSCs趨化能力的變化。主要實驗方法與結(jié)果如下： 一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的分離、培養(yǎng)與鑒定 1. BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下取3周齡雌性SD大鼠雙側(cè)脛骨、腓骨,暴露骨髓腔,含10%FBS的DMEM-F12充分沖洗骨髓腔,收集全部沖洗液,離心后留取沉淀加入10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液,于37℃,含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第三代細胞經(jīng)抗體孵育后上流式細胞儀檢測細胞表面CD44.CD45.CD31.CD29和CD166的表達情況。結(jié)果：分離出的細胞傳至第三代時形態(tài)均一,呈長梭形,其細胞表面CD44、CD29高表達,CD45、CD31和CD166低表達,符合BMSCs的免疫表型特點。 二、BMSCs CXCR4表達的測定 1.PCR法檢測BMSCs CXCR4表達 以106/孔的細胞量將第2代BMSCs接種至6孔細胞培養(yǎng)板,于10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)至細胞鋪滿60%～70%時進行雌激素干預實驗。本研究設(shè)置6個17β-E2干預濃度,即10-10、10-9、10-8、10-7、5×10-7和10-6mol/L。2個實驗組分別為E2干預組和E2拮抗組。E2拮抗組的細胞預先用10-8mo1/L雌激素受體拮抗劑ICI182780封閉1h。每組設(shè)置13個孔,分別編號為1-13號,分別以1號孔為對照。E2干預組2-7號孔和8-13號孔分別依次加入不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7、5×10-7、10-6mol/L)的17β-E2進行干預,E2拮抗組每孔在E2干預基礎(chǔ)上再向每孔以10-6mol/LICI182780拮抗雌激素受體(ER)。干預組和拮抗組的2-7號和8-13號孔E2干預時間分別為24h和48h。干預完成后收集BMSCs,PCR法檢測各孔細胞CXCR4mRNA表達情況。結(jié)果：干預24h時,CXCR4mRNA表達在10-7mol/L17β-E2誘導時表達最高；干預48h時,CXCR4mRNA在5×10-7mol/L17β-E2誘導時表達最高.10-8mol/L的ICI182780能夠明顯抑制17β-E2對BMSCs CXCR4mRNA表達的調(diào)高作用。 2.Western blot法檢測BMSCs CXCR4表達 按上述方法用各濃度17β-E2和ICI182780處理干預組和拮抗組BMSCs,收集細胞用Western blot法檢測各濃度17β-E2誘導后CXCR4蛋白的表達。結(jié)果：干預24h和48h時,CXCR4蛋白表達均在5×10-7mol/L17p-E2誘導時表達最高。10-8mol/L的ICI182780能夠明顯抑制17β-E2對BMSCs蛋白表達的調(diào)高作用。 三、17β-E2對BMSCs定向遷移影響的檢測 1.17β-E2對BMSCs向SDF-1定向遷移的影響 實驗在24孔細胞培養(yǎng)板上進行,設(shè)置對照組和E2干預組。對照組BMSCs未經(jīng)E2干預,E2干預組BMSCs預先在含10-7mol/L17.β雌二醇的10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。每組分別設(shè)置4孔,標記為1-4號。兩組孔內(nèi)均依次加入含0、100.200.300ng/mLSDF-1的無血清培養(yǎng)基500μL,利用懸掛式細胞培養(yǎng)小室transwell(8μm)觀察細胞的遷移情況。transwell內(nèi)按2×104/孔接種細胞。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h,進行洗滌、固定和伊紅染色。顯微鏡下隨機取5個視野(光鏡×100倍)計數(shù)染色細胞,SPSS13.0對遷移細胞數(shù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：對照組和E2干預組BMSCs均在SDF-1濃度為200ng/ml時細胞遷移數(shù)達到最大,且在相同SDF-1濃度下,E2干預組細胞遷移數(shù)要顯著大于對照組。 2.CXCR4阻斷實驗 設(shè)置對照組和E2干預組,標記為5號。按上述方法處理2組細胞,分別取對照組和E2干預組細胞各200μl,加入CXCR4受體阻斷劑AMD3100100ng/mL孵育30min,依照上述步驟行微孔隔離穿越實驗。結(jié)果：在對照組,CXCR4阻斷后的BMSCs細胞遷移數(shù)與對照組1號孔無明顯差異；在E2干預組,CXCR4阻斷后細胞遷移數(shù)與同組1號孔有差異。 結(jié)論：本研究成功分離、培養(yǎng)了SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,并獲得了可誘導BMSCs高表達CXCR4的17β-E2最適濃度和干預時間,以及BMSCs定向遷移的最適SDF-1濃度。研究表明,17β-E2可以通過上調(diào)BMSCs CXCR4的表達,促進BMSCs向SDF-1定向遷移,17β-E2的這種上調(diào)作用可以被雌激素受體阻斷劑ICI182780所阻斷。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R711.59

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 周劏 ,劉曉璦;經(jīng)陰道補充雌激素的臨床研究進展[J];國外醫(yī)學(計劃生育分冊);2005年05期

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本文編號：2381392