【摘要】：卵巢癌仍然是迄今致死率最高的婦科惡性腫瘤,根據(jù)美國(guó)國(guó)家健康統(tǒng)計(jì)中心2014年公布的數(shù)據(jù),美國(guó)卵巢癌總的5年生存率為44%,其中晚期病例僅為27%。自從上世紀(jì)90年代紫杉醇成為最主要的一線化療藥物以來(lái),晚期卵巢癌的近期緩解率已達(dá)到80%以上,但大多數(shù)患者在2-3年內(nèi)復(fù)發(fā),幾乎所有復(fù)發(fā)性卵巢癌對(duì)再次化療耐藥,化療耐藥是卵巢癌患者治療失敗和死亡的最主要原因之一克服紫杉醇耐藥,已成為提高卵巢癌遠(yuǎn)期生存率的關(guān)鍵。 紫杉醇是一種促微管聚合和穩(wěn)定,抗有絲分裂的細(xì)胞周期特異性藥物。研究表明,與紫杉醇耐藥相關(guān)的機(jī)制主要包括：P-糖蛋白等藥物泵蛋白表達(dá)增加；微管動(dòng)態(tài)變化異常和βⅢ微管蛋白同型分子的異常高表達(dá)；微管相關(guān)和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白阻礙紫杉醇和微管結(jié)合；促凋亡和抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)異�；蛄姿峄钚援惓５取５鶕�(jù)已有報(bào)道,各種針對(duì)這些靶點(diǎn)的阻遏方法僅能部分逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥,事實(shí)上迄今尚沒(méi)有一種基于上述機(jī)制建立的逆轉(zhuǎn)耐藥的方法應(yīng)用于臨床。卵巢癌耐藥的關(guān)鍵機(jī)制尚有待闡明。 近期研究表明紫杉醇耐藥還與自噬(Autophagy)相關(guān)。自噬屬于程序性細(xì)胞死亡,發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)60年代早期。自噬現(xiàn)象廣范存在于多細(xì)胞生物體內(nèi),參與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和維持代謝平衡。近年發(fā)現(xiàn),自噬與腫瘤密切相關(guān)。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)與溶酶體融合的途徑不同,自噬可以分為分子伴侶介導(dǎo)的自噬、微自噬和巨自噬。巨自噬,也即通常所說(shuō)的自噬,其主要特點(diǎn)是細(xì)胞漿內(nèi)的雙層膜結(jié)構(gòu),包裹部分長(zhǎng)周期蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器,形成自噬小泡,自噬小泡進(jìn)一步與溶酶體融合形成自噬-溶酶體,其包裹的內(nèi)容物經(jīng)過(guò)溶酶體水解酶的降解,又再次釋放到細(xì)胞質(zhì)中。這一過(guò)程受到精密調(diào)控,自上而下涉及Atgl/Atg13/Atg17復(fù)合物、Vps34/Beclinl/Atg14復(fù)合物、Atg5/Atgl2/Atg16復(fù)合物和LC3等,其中Beclinl是最重要的自噬調(diào)控分子之一,處于自噬調(diào)控的關(guān)鍵位置。目前認(rèn)為,依賴于細(xì)胞的不同狀態(tài)和細(xì)胞所受刺激的不同,自噬既可以引起細(xì)胞程序化死亡,也可以促進(jìn)細(xì)胞存活。當(dāng)細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生改變,不利于細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)(如營(yíng)養(yǎng)受限或者藥物作用),細(xì)胞可通過(guò)自噬過(guò)程的分解代謝提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或清除受損的蛋白和細(xì)胞器,維持細(xì)胞生存；而持續(xù)的自噬又可導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡。近年發(fā)現(xiàn),自噬既是化療藥物作用后腫瘤細(xì)胞死亡的形式之一,更重要的,它也是腫瘤細(xì)胞耐受化療藥物作用的機(jī)制之一。因此,闡明自噬的調(diào)控機(jī)制及其在卵巢癌紫杉醇耐藥中的作用,將為卵巢癌的藥物治療開(kāi)辟嶄新的領(lǐng)域。 本課題組在前期研究中,對(duì)卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞SKOV3-TR30和親代SKOV3細(xì)胞采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行篩選,進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR和Western Blot驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白相關(guān)蛋白14(TRP14)在紫杉醇耐藥細(xì)胞株中表達(dá)顯著升高。TRP14是一種新發(fā)現(xiàn)的二硫還原酶。人源TRP14蛋白由123個(gè)氨基酸殘基組成,相對(duì)分子質(zhì)量為14KD,與含有105個(gè)氨基酸殘基的硫氧還蛋白1(Trx1)具有20%的序列一致性和37%的相似性,含有保守的CPDC模序,活性半胱氨酸殘基分別為Cys43和Cys46,因此屬于Trx蛋白家族。目前對(duì)TRP14的功能了解甚少,僅有的報(bào)道提示TRP14參與腫瘤壞死因子(TNF-α)信號(hào)途徑的調(diào)控。目前已經(jīng)明確在多種細(xì)胞中,INF-α信號(hào)途徑均能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。因此前期的研究基礎(chǔ)和相關(guān)文獻(xiàn)提示,卵巢癌細(xì)胞中TRP14高表達(dá)可能與紫杉醇耐藥和自噬相關(guān)。 本研究首先通過(guò)Western Blot、GPF-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和透射電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)紫杉醇可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞自噬小泡生成,增強(qiáng)自噬流,并同步上調(diào)TRP14表達(dá)；采用siRNA干擾Beclinl可抑制卵巢癌細(xì)胞自噬,并增加卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性。進(jìn)一步采用siRNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染調(diào)控TRP14表達(dá)可同步改變Beclinl表達(dá)和細(xì)胞自噬水平,進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性。通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在卵巢癌組織中均有TRP14和Beclinl表達(dá),且TRP14和Beclinl高表達(dá)與卵巢癌病人化療耐藥,高危臨床病理參數(shù)和更差的預(yù)后相關(guān)。TRP14通過(guò)Beclinl的參與調(diào)控細(xì)胞自噬水平,進(jìn)而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥。TRP14和Beclinl表達(dá)可作為預(yù)測(cè)卵巢癌病人化療反應(yīng)和預(yù)后的指標(biāo)。 第一部分紫杉醇激活的自噬誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥 目的： 觀察紫杉醇作用于卵巢癌細(xì)胞后,自噬小泡生成和自噬流的改變；明確紫杉醇誘導(dǎo)的自噬水平改變對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的調(diào)控作用。 方法： 以不同濃度紫杉醇作用于卵巢癌細(xì)胞一定時(shí)間后,采用Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B, Atg5和Beclinl的表達(dá),以共聚焦熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒后GFP-LC3-Ⅱ陽(yáng)性小泡數(shù)量,透射電鏡觀察自噬小泡超微結(jié)構(gòu),綜合評(píng)價(jià)紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞自噬小泡的誘導(dǎo)作用。同時(shí)以溶酶體抑制劑BafA1抑制溶酶體降解過(guò)程,采用Western Blot檢測(cè)LC3B-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)變化,觀察紫杉醇作用于卵巢癌細(xì)胞后自噬流的改變。進(jìn)一步干擾自噬調(diào)控基因Beclinl抑制自噬,觀察自噬對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的影響。 結(jié)果： 1.紫杉醇誘導(dǎo)A2780,3A0, SKOV3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ, Atg5和Beclinl表達(dá)顯著增加 2.10nM紫杉醇作用于A2780,3A0, SKOV3細(xì)胞24h后,共聚焦免疫熒光發(fā)現(xiàn)GFP-LC3B-Ⅱ陽(yáng)性小泡數(shù)量顯著增加,在透視電鏡下觀察到更多自噬小泡或自噬-溶酶體融合泡。 3.利用BafAl抑制溶酶體降解后,在紫杉醇作用組導(dǎo)致的LC3B-Ⅱ和p62表達(dá)增加更加顯著。 4. siRNA干擾Beclinl表達(dá)可抑制A2780和3AO細(xì)胞自噬水平,并增加細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。 結(jié)論： 1.紫杉醇可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞自噬小泡形成、增強(qiáng)自噬流。 2.紫杉醇激活的自噬誘導(dǎo)了卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥。 第二部分TRP14通過(guò)Beclinl調(diào)控自噬并誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥 目的： 證明TRP14通過(guò)自噬調(diào)控蛋白Beclinl的參與,調(diào)控卵巢癌細(xì)胞自噬,進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。 方法： 首先觀察紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞TRP14表達(dá)的影響；再以siRNA干擾TRP14表達(dá),以pcDNA3.1(+)-TRP14質(zhì)粒高表達(dá)TRP14,觀察卵巢癌細(xì)胞在紫杉醇作用時(shí)和饑餓狀態(tài)下Beclinl表達(dá)和自噬水平改變；及其卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的變化。 結(jié)果： 1.紫杉醇可誘導(dǎo)A2780,3A0, SKOV3細(xì)胞TRP14表達(dá)增加。 2.以siRNA下調(diào)A2780和3AO細(xì)胞TRP14表達(dá),可同步下調(diào)Beclinl, LC3B-Ⅱ, Atg5的表達(dá)；相反以pcDNA3.1(+)-TRP14上調(diào)TRP14表達(dá),則可同步上調(diào)Beclinl, LC3B-Ⅱ, Atg5的表達(dá),且Beclinl干擾可再次抑制LC3B-Ⅱ, Atg5表達(dá)。 3.以siRNA下調(diào)TRP14表達(dá),可增加A2780和3AO細(xì)胞紫杉醇敏感性；相反以pcDNA3.1(+)-TRP14上調(diào)TRP14表達(dá),則可降低細(xì)胞紫杉醇敏感性,且Beclin1干擾后,紫杉醇敏感性再次增加。 結(jié)論： 1.TRP14是卵巢癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的重要調(diào)控分子。 2.TRP14通過(guò)調(diào)控Beclin1表達(dá)改變卵巢癌細(xì)胞的自噬水平,進(jìn)而影響其對(duì)紫杉醇的敏感性。 第三部分TRP14和Beclinl在卵巢癌組織中的表達(dá)和臨床意義 目的： 觀察TRP14和Beclinl在卵巢癌組織中的表達(dá)和臨床意義。 方法： 利用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)TRP14和自噬調(diào)控蛋白Beclinl在157例卵巢癌組織中的表達(dá),并分析與卵巢癌病人年齡、FIGO分期、腫瘤分級(jí)、腹水量、術(shù)前血清CA125水平、初次手術(shù)滿意度、化療敏感性等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,及其對(duì)無(wú)瘤生存時(shí)間(PFS)和總生存時(shí)間(OS)的影響。 結(jié)果： 1.TRP14高表達(dá)與化療耐藥、更高的血清CA125水平和不滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)顯著相關(guān)。TRP14高表達(dá)的卵巢癌病人表現(xiàn)為更短的PFS和OS。 2. Beclinl高表達(dá)與化療耐藥、更高級(jí)別的FIGO分期,更高的血清CA125水平和不滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)顯著相關(guān)。Beclinl高表達(dá)的卵巢癌病人表現(xiàn)為更短的PFS和OS。 3.TRP14高表達(dá)和Beclinl高表達(dá)顯著相關(guān)。 結(jié)論： 1.TRP14和Beclinl在卵巢癌組織中的表達(dá)存在顯著相關(guān)性,其高表達(dá)均與卵巢癌耐藥、高危臨床病理參數(shù)和不良預(yù)后顯著相關(guān)。 2.卵巢癌組織TRP14和Beclinl表達(dá)可作為預(yù)測(cè)卵巢癌化療反應(yīng)和預(yù)后的指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2372645