【摘要】：人乳頭瘤病毒(HPV)是一類(lèi)能夠感染皮膚和粘膜的DNA病毒。高危型HPV是宮頸癌以及癌前病變的主要致病因子。目前，，在臨床上沒(méi)有治療宮頸癌的恰當(dāng)措施，因此預(yù)防性HPV疫苗的研制尤為重要。雖然已經(jīng)有兩種預(yù)防性病毒樣顆粒（VLPs）疫苗被批準(zhǔn)上市，但是它們不僅穩(wěn)定性差、造價(jià)高，而且具有免疫上嚴(yán)格的型別特異性，所以廉價(jià)、高效的第二代廣譜疫苗的研發(fā)勢(shì)在必行。本論文以降低HPV疫苗成本和提高其廣譜性為出發(fā)點(diǎn)，以揭示HPV衣殼蛋白L1自組裝機(jī)理和關(guān)鍵組裝因素為目的，主要開(kāi)展了由單體到五聚體、再到VLPs的體外可控組裝過(guò)程研究。主要內(nèi)容如下： （一）、在大腸桿菌表達(dá)體系中，我們以L(fǎng)1五聚體形成VLPs的分子機(jī)制為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)、構(gòu)建并表達(dá)了兩個(gè)具有新型結(jié)構(gòu)的重組L1蛋白——HPV16L1Bi和HPV18L1Bi。在原有的分子間作用力的驅(qū)動(dòng)下首次成功地制備出一種新型的、同時(shí)含有兩種HPV型別的雜合HPV16/18L1Bi VLPs。利用蔗糖密度梯度離心和免疫共沉淀(Co-IP)的方法進(jìn)一步純化得到了VLPs的純雜合子，其中HPV16和HPV18L1五聚體的比例約是3:5。雜合的VLPs針對(duì)HPV16和HPV18型別均能誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體，具有這兩個(gè)型別的免疫原性。本研究為含有多種型別雜合VLPs疫苗的研發(fā)提供了新思路，也為生物大分子自組裝過(guò)程的調(diào)控和關(guān)鍵因素的揭示奠定了理論基礎(chǔ)。 （二）、在上述研究中，我們還發(fā)現(xiàn)所有型別乳頭瘤病毒L1蛋白C-末端α-螺旋5（h5）序列中的LGR具有絕對(duì)保守性。利用基因工程技術(shù)把HPV16L1蛋白序列中的464LGR466分別被點(diǎn)突變成丙氨酸（Ala, A）后所表達(dá)的L1蛋白均僅以單體形式存在，無(wú)法再組裝成五聚體。表明LGR是形成L1五聚體必不可少的氨基酸，這是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的阻斷L1五聚體形成的最小結(jié)構(gòu)單元�；诖耍覀円訦PV16L1蛋白h5為靶標(biāo)設(shè)計(jì)合成了一條包括h5在內(nèi)的15肽，它能夠有效地抑制L1五聚體的形成，表明h5是潛在的抗病毒靶點(diǎn)，可以以此制備出以h5為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的靶向性小肽藥物。另外，HPV16L1蛋白469位的亮氨酸（Leu, L）被突變成丙氨酸后，其可溶性五聚體的產(chǎn)量至少增加1倍。本研究為抗HPV藥物的研發(fā)以及降低HPV疫苗成本奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Human papillomavirus (HPV) is a class of DNA viruses that can infect skin and mucosa. High risk HPV is the main pathogenic factor of cervical cancer and precancerous lesions. At present, there is no clinical treatment for cervical cancer, so the development of prophylactic HPV vaccine is particularly important. Although two prophylactic virus-like (VLPs) vaccines have been approved for sale, they are not only unstable and expensive, but also have strict type specificity in immunization, so they are cheap. The development of high-efficient second-generation wide-spectrum vaccine is imperative. In order to reduce the cost of HPV vaccine and improve its broad spectrum, and to reveal the mechanism of HPV capsid protein L1 self-assembly and key assembly factors, this paper mainly studied the controllable assembly process from monomer to pentamer to VLPs in vitro. The main contents are as follows: (1) in Escherichia coli expression system, we designed, constructed and expressed two novel recombinant L1 proteins, HPV16L1Bi and HPV18L1Bi., based on the molecular mechanism of L1 pentamer forming VLPs. A novel hybrid HPV16/18L1Bi VLPs. with two HPV types was successfully prepared under the driving of the original intermolecular force for the first time. The homozygote of VLPs was further purified by sucrose density gradient centrifugation and immunoprecipitation (Co-IP), in which the ratio of HPV16 to HPV18L1 was about 3: 5. Heterozygous VLPs can induce the production of high titer neutralizing antibodies against both HPV16 and HPV18 types and has the immunogenicity of these two types. This study provides a new idea for the research and development of VLPs vaccine containing multiple types of heterozygotes. It also lays a theoretical foundation for the regulation of self-assembly process of biological macromolecules and the disclosure of key factors. (2) in the above studies, we also found that LGR in the C-terminal 偽 -helix 5 (H5) sequence of all types of papillomavirus L1 protein is absolutely conserved. The L1 protein expressed after the 464LGR466 of HPV16L1 protein was mutated into alanine (Ala, A) by genetic engineering was expressed in the form of monomers and could not be assembled into pentamers. It is shown that LGR is the essential amino acid to form L1 pentamers, which is the smallest structural unit found so far to block the formation of L1 pentamers. Based on this, we designed and synthesized a 15-peptide including H5, which can effectively inhibit the formation of L1 pentamers, indicating that H5 is a potential antiviral target. Thus, the targeted small peptide drugs based on the structure of H 5 can be prepared. In addition, when leucine (Leu, L) at position 469 of HPV16L1 protein was mutated to alanine, the yield of soluble pentamer increased at least double. This study has laid a foundation for the development of anti-HPV drugs and reducing the cost of HPV vaccine.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.33;R392

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本文編號(hào)：2371556