【摘要】：目的：探討二氧化硒（SeO2）對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其表觀調(diào)控機(jī)制，明確硒化合物抗腫瘤作用的機(jī)制，為其作為抗癌藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1. 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：選擇不同HPV亞型宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞、Caski細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組予不同濃度SeO2（1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L）處理24h，空白對(duì)照組予無(wú)血清培養(yǎng)基。根據(jù)待測(cè)指標(biāo)需要取樣待測(cè)。 2.指標(biāo)檢測(cè)：倒置光學(xué)顯微鏡下觀察不同組兩株細(xì)胞株經(jīng)過(guò)SeO2處理后的形態(tài)學(xué)變化；用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)SeO2對(duì)細(xì)胞增殖及活力的影響；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率；用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、P53蛋白表達(dá)的水平；Step-loop實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)microRNA(miRNA) let-7a的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1. 形態(tài)學(xué)觀察：倒置光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，SeO2對(duì)體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株生長(zhǎng)形態(tài)均產(chǎn)生明顯影響。與對(duì)照組細(xì)胞相比，細(xì)胞變圓皺縮，胞內(nèi)顆粒增多，失去正常形態(tài)，，貼壁細(xì)胞減少，增殖減慢；隨著SeO2作用濃度的提高，細(xì)胞密度逐漸降低，細(xì)胞間間隙逐步增大，呈劑量依賴性。 2.細(xì)胞增殖活力分析：采用MTT法檢測(cè)SeO2對(duì)不同宮頸癌細(xì)胞株抑制作用，結(jié)果示SeO2對(duì)宮頸癌細(xì)胞株的抑制作用呈量效依賴關(guān)系，Hela細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組（1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L）細(xì)胞抑制率分別為1.22%、20.25%、35.03%、43.56%、60.74%，其中7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L濃度組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；SeO2對(duì)Caski細(xì)胞的抑制作用隨藥物濃度的升高亦呈明顯上升趨勢(shì)，各實(shí)驗(yàn)組（1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L）細(xì)胞抑制率分別為14.39%、34.08%、43.01%、57.73%、68.65%，與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。 3.凋亡檢測(cè)：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度SeO2對(duì)宮頸癌細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用。隨著SeO2藥物濃度的升高，誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng)，呈濃度依賴性。0μmol/L、1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L濃度SeO2誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡率分別為3.12%、30.56%、33.42%、37.50%、45.43%、69.38%，0μmol/L、1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L濃度SeO2誘導(dǎo)Caski細(xì)胞凋亡率分別為3.7%、10.7%、67.5%、78.2%、87.1%、85.2%，凋亡率均隨藥物濃度增加呈上升趨勢(shì)。 4. Caspase-3、P53蛋白表達(dá)水平測(cè)定：采用Western blot技術(shù)分析不同細(xì)胞組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示SeO2可明顯上調(diào)宮頸癌細(xì)胞株中Caspase-3與P53蛋白水平。對(duì)Hela細(xì)胞的Caspase-3、P53蛋白表達(dá)上調(diào)作用于7.5μmol/L處達(dá)到峰值，各實(shí)驗(yàn)組較空白組均有顯著差異（P＜0.05）。Caski細(xì)胞中低濃度組Caspase-3蛋白誘導(dǎo)作用不明顯，至7.5μmol/L、15μmol/L及30μmol/L濃度蛋白表達(dá)量較空白組有顯著差異（P＜0.05）。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)P53蛋白水平的誘導(dǎo)作用較空白組均有顯著差異（P＜0.05）。 5. Let-7a表達(dá)水平分析：Step-loop實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同組宮頸癌細(xì)胞株凋亡相關(guān)miRNA let-7a表達(dá)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞let-7a表達(dá)水平顯著提高，在7.5μmol/L處出現(xiàn)峰值，－"

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