【摘要】：研究背景與目的 近年來,宮頸癌發(fā)病率在某些地區(qū)有明顯上升趨勢(shì),且患者年輕化趨勢(shì)越來越明顯。目前已明確宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的持續(xù)感染相關(guān),但有研究表明年輕婦女的HPV感染通常是一過性的,因此,在宮頸癌早期篩查中HPV檢測(cè)實(shí)驗(yàn)不能很好的鑒別靜止和持續(xù)感染,再加上目前宮頸癌手術(shù)、放療和化療存在一定局限性,研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找新的能夠用于治療和病情監(jiān)測(cè)指標(biāo)的靶分子成為亟待解決的重大問題。 lncRNA是近年研究發(fā)現(xiàn)的在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)并廣泛參與幾乎所有生理和病理過程的一類非編碼RNA。實(shí)驗(yàn)室前期在太空誘變宮頸癌細(xì)胞中篩選獲得一個(gè)表達(dá)上調(diào)的長(zhǎng)片段非編碼RNA基因MALAT1,MALAT1是定位于染色體11q13,核酸序列為8708bp,在多種腫瘤中被異常調(diào)控,與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但MALAT1與宮頸癌的關(guān)系目前還未見其他實(shí)驗(yàn)室有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。本課題擬通過RT-PCR方法檢測(cè)MALAT1在宮頸癌細(xì)胞系和宮頸上皮細(xì)胞樣本中的表達(dá)；用RNA沉默技術(shù)和過表達(dá)技術(shù)分別構(gòu)建干擾和過表達(dá)MALAT1的穩(wěn)定細(xì)胞系,從正反兩方面研究MALAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)表型的影響；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)MALAT1影響宮頸癌細(xì)胞增殖的下游信號(hào)分子進(jìn)行探索。方法 1.收集宮頸癌細(xì)胞系和宮頸上皮細(xì)胞樣本,提取RNA后,用RT-PCR的方法檢測(cè)MALAT1的表達(dá),分析MALAT1的表達(dá)與宮頸癌的相關(guān)性。 2.用MALAT1過表達(dá)載體pEGFP-C1轉(zhuǎn)染laCat細(xì)胞和SiHa細(xì)胞,用MALAT1沉默載體pRNAT-U6.1/Neo轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞,通過G418篩選和有限稀釋法建立穩(wěn)定的陽性細(xì)胞株。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MALAT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)表型的影響。 3.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MALAT1改變后細(xì)胞周期的變化,用RT-PCR的方法檢測(cè)影響細(xì)胞周期的相關(guān)分子,分析MALAT1調(diào)控細(xì)胞增殖的相關(guān)分子。結(jié)果 1.MALAT1高表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞系Hela、CaSki、SiHa、HCC94和宮頸病變上皮細(xì)胞樣本中,而在正常細(xì)胞HaCat和正常宮頸上皮細(xì)胞樣本中未檢測(cè)到MALAT1的表達(dá),表明MALAT1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。 2.經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建MALAT1過表達(dá)載體pEGFP-C1/M1,將沉默載體和過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,成功建立MALAT1沉默和過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系；沉默MALAT1后,宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,克隆形成能力降低,細(xì)胞遷移能力下降；過表達(dá)MALAT1后細(xì)胞生長(zhǎng)未出現(xiàn)明顯變化,細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。 3. MALAT1沉默后,G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,細(xì)胞周期蛋白cyclinD1、cyclinE、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK6表達(dá)明顯降低,CDK4沒有明顯變化,表明MALAT1通過調(diào)控G1/S期相關(guān)分子的表達(dá)影響宮頸癌細(xì)胞增殖。結(jié)論 1. MALAT1在宮頸癌中高表達(dá),與宮頸癌發(fā)生相關(guān)。 2. MALAT1在宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用。 3. MALAT1通過改變周期相關(guān)分子的表達(dá)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.33

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2319363