【摘要】：研究背景 子宮內(nèi)膜異位癥現(xiàn)已成為育齡期女性的常見病、多發(fā)病,近年來其發(fā)病趨勢明顯上升,達(dá)10%-15%,故又有“現(xiàn)代病”之稱。子宮內(nèi)膜異位癥主要引起不孕、痛經(jīng)、性交痛及慢性盆腔痛等癥狀,嚴(yán)重影響了婦女健康和生活質(zhì)量。子宮內(nèi)膜異位癥雖是一種良性疾病,但病變廣泛、形態(tài)多樣,具有種植、侵襲、擴(kuò)散、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為。 子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制目前仍不明確。1921年Sampson提出經(jīng)血逆流學(xué)說后得到了多數(shù)臨床和實驗資料的支持,但經(jīng)血逆流至盆腔是常見的,甚至是生理現(xiàn)象,多數(shù)人并未罹患子宮內(nèi)膜異位癥。近年來,我國學(xué)者提出“在位內(nèi)膜決定論”,認(rèn)為在位子宮內(nèi)膜的生物學(xué)特性是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的決定因素。在卵巢性激素的周期性調(diào)控下,子宮內(nèi)膜產(chǎn)生的細(xì)胞因子也發(fā)生周期性改變,這其中就包括Activin A及其相關(guān)生長因子(Follistatin、Cripto)。正常生理狀態(tài)下,在卵巢激素的調(diào)控下,子宮內(nèi)膜從增殖期轉(zhuǎn)化到分泌期,Activin A逐步升高,至分泌晚期達(dá)到最高水平,Cripto在增殖期增高,而Follistatin則一直處于相對的低水平。最新研究表明,子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜Activin A mRNA表達(dá)于月經(jīng)周期無顯著性改變,增生期顯著高于正常月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜,但無分泌期表達(dá)高峰；Follistatin mRNA表達(dá)在分泌期顯著高于增生期及正常月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜；Cripto mRNA表達(dá)在增生期及分泌期無顯著性差異,無分泌期降調(diào)。由此我們推斷,子宮內(nèi)膜組織內(nèi)Activin A及其相關(guān)生長因子之間可能存在著某種動態(tài)平衡,這種動態(tài)平衡決定了Activin信號通路的開放與阻斷,從而表達(dá)所需要的生理效應(yīng)。目前已有研究表明Activin A、Follistatin、Cripto之間動態(tài)平衡的改變可增強在位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、粘附、侵襲及血管生成能力,并促使其釋放加速內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞因子。但是,影響在位子宮內(nèi)膜Activin A、Follistatin、Cripto表達(dá)及分泌的原因目前仍不清。 眾所周知,內(nèi)異癥是一種性激素依賴性疾病,也是一種炎癥性疾病,大量的炎性因子表達(dá)異常,白細(xì)胞介素-1β即為其中重要分子之一。那么,炎性因子及雌激素是否參與到Actin A及其相關(guān)因子的調(diào)控中來呢?本課題擬對此進(jìn)行探討,觀察白細(xì)胞介素-1β及雌激素對子宮內(nèi)膜異位癥增生期在位子宮內(nèi)膜Activin A、Follistatin以及Cripto等因子的影響。 從1885年Von Recklinghausen首次提出并命名子宮內(nèi)膜異位癥至今已超過一個世紀(jì),盡管現(xiàn)已初步建立子宮內(nèi)膜異位癥的臨床診療策略,但目前仍舊面臨疼痛與不育,術(shù)后或停藥后復(fù)發(fā)率高,深部病灶處理棘手等問題,新的治療方案一直是人們探索的熱點。子宮內(nèi)膜異位癥的分子機理研究為治療提供了新的對策,如促進(jìn)分泌期內(nèi)膜蛻膜化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抗粘附,抗侵襲,抗血管生成等。子宮內(nèi)膜異位癥在位與異位內(nèi)膜Activin A mRNA于分泌期表達(dá)減少,其拮抗物Follistatin及Cripto mRNA表達(dá)增多。由此我們推測這使得Activin A于分泌期作用減弱,內(nèi)膜喪失蛻膜化機會,提高了異位種植生長的機會；且Cripto可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管形成等。這亦可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。因此本研究以Cripto中和性封閉單克隆抗體作用于體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜異位癥分泌期異位內(nèi)膜間質(zhì)及上皮細(xì)胞,在細(xì)胞水平初步探討Cripto中和性封閉單克隆抗體對子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用。 目的 本研究擬原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜異位癥增生期在位內(nèi)膜標(biāo)本,鑒定證實為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞后,以不同濃度的白細(xì)胞介素-1β及雌激素進(jìn)行干預(yù),采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附試驗,分別從mRNA及蛋白水平檢測Activin A、Follistatin、Cripto的變化。同時分離、培養(yǎng)、鑒定卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫內(nèi)壁的分泌期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及上皮細(xì)胞,鑒定為間質(zhì)細(xì)胞及上皮細(xì)胞后,分別設(shè)立Cripto中和性封閉單克隆抗體處理組和空白對照組。以Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)晶紫染色法檢測細(xì)胞粘附,Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲。探討白細(xì)胞介素1β及雌激素對子宮內(nèi)膜異位癥增生期在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞Activin A、Follistatin、Cripto表達(dá)及蛋白分泌的影響以及Cripto中和性封閉單克隆抗體對子宮內(nèi)膜異位癥分泌期異位內(nèi)膜細(xì)胞的抑制作用。為進(jìn)一步探索子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制提供有價值的科研資料并為子宮內(nèi)膜異位癥的治療策略提供新的思路和方法,解除患者痛苦,降低復(fù)發(fā)率,減少癌變,提高生育能力,改善臨床治療效果。 方法 1.收取子宮內(nèi)膜異位癥患者增生期在位子宮內(nèi)膜,采用酶消化的方法分離出人子宮內(nèi)膜細(xì)胞,用200目的濾網(wǎng)過濾后,分離出間質(zhì)細(xì)胞,并用波形蛋白和角蛋白鑒定。 2.取培養(yǎng)至第三代的對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,以不同濃度的白細(xì)胞介素-1β (250pg/ml,500pg/ml,750pg/ml)、雌激素(10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L)及雌激素+白細(xì)胞介素-1β(10-6mol/L雌激素+500pg/ml白細(xì)胞介素-1β)進(jìn)行干預(yù)。 3.利用RT-qPCR技術(shù)檢測干預(yù)前后Activin A、Follistatin、Cripto mRNA表達(dá)的改變情況。 4.利用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測干預(yù)前后Activin A、Follistatin、Cripto蛋白分泌水平的改變情況。 5.收取分泌期卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫內(nèi)壁標(biāo)本,采用組織塊貼壁法,分離出基質(zhì)細(xì)胞及上皮細(xì)胞,用波形蛋白和角蛋白分別對兩種細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 6.取培養(yǎng)至第三代的對數(shù)生長期的間質(zhì)細(xì)胞及培養(yǎng)至第一代的對數(shù)生長期上皮細(xì)胞,分別設(shè)立Cripto單克隆中和抗體處理組(加入Cripto單克隆中和抗體至終濃度為5μg/mL)和空白對照組(僅加入完全培養(yǎng)基)。 7.利用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)分別檢測Cripto單克隆中和抗體處理組和空白對照組細(xì)胞凋亡的改變情況。 8.利用結(jié)晶紫染色法分別檢測Cripto單克隆中和抗體處理組和空白對照組細(xì)胞粘附能力的改變。 9.利用Transwell小室法分別檢測Cripto單克隆中和抗體處理組和空白對照組細(xì)胞侵襲能力改變情況。 10.統(tǒng)計學(xué)分析：本實驗所有數(shù)據(jù)計量資料用算術(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)描述,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,Bonferroni檢驗進(jìn)行組間比較,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。兩組間均數(shù)比較做方差齊性檢驗后,采用兩獨立樣本t檢驗,檢驗水準(zhǔn)均為α=0.05。 結(jié)果 1.在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、觀察及鑒定 在長滿整個培養(yǎng)瓶前,細(xì)胞彼此分開,形態(tài)較扁平,外形輪廓不太清楚,核不明顯。當(dāng)細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時,細(xì)胞排列緊密,呈細(xì)長梭形,呈平行排列。細(xì)胞免疫組化鑒定示波形蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性。 2.經(jīng)白細(xì)胞介素-1β及雌激素刺激,Activin A、Cripto的mRNA表達(dá)較對照組呈劑量依賴性增加(P0.05)。經(jīng)白細(xì)胞介素1β刺激,Follistatin的mRNA表達(dá)較對照組呈劑量依賴性增加(P0.05)；經(jīng)雌激素刺激,各組Follistatin mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)雌激素及白細(xì)胞介素-1β共同刺激,Activin A、 Cripto的mRNA表達(dá)較對照組、雌激素組及白細(xì)胞介素-1β組增加(P0.05)；Follistatin的mRNA表達(dá)較對照組及雌激素組增加(P0.05),較白細(xì)胞介素-1β組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 3.經(jīng)白細(xì)胞介素-1β及雌激素刺激,Activin A蛋白分泌較對照組呈劑量依賴性增加(P0.05)。經(jīng)白細(xì)胞介素-1β刺激,Follistatin蛋白分泌較對照組呈劑量依賴性增加(P0.05)；經(jīng)雌激素刺激,各組Follistatin蛋白分泌無統(tǒng)計學(xué)差異。白細(xì)胞介素-1β濃度為500pg/ml時,Cripto含量較對照組增加(P0.05)。雌激素濃度為10-6mol/L及10-5mol/L時,Cripto蛋白分泌較對照組增加(P0.05)。經(jīng)雌激素及白細(xì)胞介素-1β共同刺激,Activin A、Follistatin蛋白分泌較對照組、白細(xì)胞介素-1β組及雌激素組增加(P0.05)；Cripto蛋白分泌較對照組增加(P0.05)。 4.異位內(nèi)膜細(xì)胞的培養(yǎng)、觀察及鑒定間質(zhì)細(xì)胞在長滿整個培養(yǎng)瓶前,分散生長,呈伸展?fàn)?外形輪廓不甚清楚,核不明顯。長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時,細(xì)胞排列緊密,細(xì)長梭形,呈平行排列。細(xì)胞免疫組化鑒定示波形蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性。上皮細(xì)胞為致密細(xì)胞集落,呈插入性生長,多角形或蝌蚪狀,輪廓清晰,核較大且明顯,旋渦狀或團(tuán)狀排列。細(xì)胞免疫組化鑒定示波形蛋白染色陰性,角蛋白染色陽性。 5. Cripto中和性封閉單克隆抗體分別作用于子宮內(nèi)膜異位癥分泌期異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞,可見凋亡細(xì)胞較對照組增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 6. Cripto中和性封閉單克隆抗體分別作用于子宮內(nèi)膜異位癥分泌期異位內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞,可抑制細(xì)胞粘附,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 7. Cripto中和性封閉單克隆抗體分別作用于子宮內(nèi)膜異位癥分泌期異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞,穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 1.白細(xì)胞介素1β及雌激素可影響子宮內(nèi)膜異位癥增生期在位內(nèi)膜Activin A、Follistatin、Cripto的分泌及表達(dá),提示其可能參與Activin A及相關(guān)因子的調(diào)控。 2. Cripto中和性封閉單克隆抗體可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥分泌期異位內(nèi)膜間質(zhì)、上皮細(xì)胞凋亡,并抑制其粘附、侵襲,提示通過拮抗Cripto蛋白可能可以抑制子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R711.71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2301909