【摘要】：目的人胚胎干細(xì)胞起源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有無限自我更新及體內(nèi)外分化成人體任何一種細(xì)胞類型的能力，胚胎干細(xì)胞全能性特征可為細(xì)胞替代治療及藥物篩選提供大量資源。人胚胎干細(xì)胞系1998年就已建立，但是胚胎干細(xì)胞系的發(fā)育潛能和表觀遺傳特性存在很大差異，導(dǎo)致用于人體移植治療時(shí)會(huì)出現(xiàn)HLA免疫排斥問題。國內(nèi)干細(xì)胞株數(shù)遠(yuǎn)不能滿足HLA匹配數(shù)，還需要建大量不同胚胎來源的干細(xì)胞株。在大部分IVF胚胎室，受精卵通常培養(yǎng)至第3天（D3），所有胚胎經(jīng)形態(tài)學(xué)評(píng)分后，高評(píng)分胚胎用于移植或冷凍，低評(píng)分胚胎由于發(fā)育潛能不足，序貫培養(yǎng)獲得囊胚著床率低、死亡率及染色體異常率高，通常予以丟棄。盡管形態(tài)學(xué)評(píng)分目前是大多數(shù)生殖中心的胚胎判斷標(biāo)準(zhǔn)，但并不是胚胎發(fā)育潛能的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究收集D3低質(zhì)量廢棄胚胎，序貫培養(yǎng)至D6，囊胚擴(kuò)張后（3級(jí)及以上）行玻璃化冷凍，凍融后培養(yǎng)至D8或D9接種，本研究在常規(guī)建系方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，嘗試用D6天低質(zhì)量?jī)鋈谀遗哌M(jìn)行干細(xì)胞建系，為人廢棄胚胎干細(xì)胞建系提供材料和方法學(xué)參考。 方法（1）囊胚序貫培養(yǎng)、冷凍：本實(shí)驗(yàn)開始前已獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的同意，，并且所有提供廢棄胚胎的夫婦均已簽署知情同意書，同意其廢棄胚胎用于科研。收集本中心D3廢棄胚胎行序貫培養(yǎng)，獲得的囊胚玻璃化冷凍儲(chǔ)存。 （2）胚胎解凍、培養(yǎng)：胚胎解凍后序貫培養(yǎng)至D8或D9，觀察囊胚形態(tài)變化，對(duì)含有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的存活囊胚進(jìn)行接種。 （3）接種、傳代：接種之前鏈蛋白酶消化去除透明帶，機(jī)械打孔成功后接種，待原代集落長出后，將原代集落接種至事先準(zhǔn)備好的小鼠飼養(yǎng)層上，7天傳代一次。 （4）胚胎干細(xì)胞特征鑒定：分別取不同代次的胚胎干細(xì)胞行堿性磷酸酶染色，干細(xì)胞體內(nèi)外分化，免疫組化熒光染色以及染色體核型分析。 結(jié)果（1）囊胚形成率：共收集168枚低形態(tài)學(xué)評(píng)分的D3廢棄胚胎，參照SteerCV的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，所有胚胎的單胚胎評(píng)分均小于16分。序貫培養(yǎng)至D6天共獲得低質(zhì)量囊胚（包括3CB,3BC,4CB,4CC）32枚，復(fù)蘇后存活26枚，囊胚形成率19.0%，復(fù)蘇存活率81.3%。 （2）復(fù)蘇、接種后生長狀況：復(fù)蘇后存活的囊胚26枚，均含有不同形狀大小的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，分離出原代克隆8個(gè)，其中2個(gè)在傳代過程中分化，其余2個(gè)原代克隆準(zhǔn)備傳第2代時(shí)出現(xiàn)污染。我們從一個(gè)4CB及3BC的囊胚成功分離培養(yǎng)出hESC，其中1株已傳36代，另一株已傳20代。 （3）hESC的生物學(xué)特性分析：傳代過程中的干細(xì)胞集落表現(xiàn)出典型的干細(xì)胞克隆特征，細(xì)胞間連結(jié)緊密，與周圍飼養(yǎng)層細(xì)胞形成明顯的界限；堿性磷酸酶AKP染色強(qiáng)陽性；間接免疫熒光著色，干細(xì)胞集落高表達(dá)OCT-4抗體；完整干細(xì)胞集落免疫表型分析顯示細(xì)胞集落TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4表達(dá)陽性。D26，D36染色體核型分析均為正常二倍體核型，46XX。干細(xì)胞集落接種到SCID小鼠腹股溝皮下，10周后形成的畸胎瘤可見3個(gè)胚層的細(xì)胞，包括角化復(fù)層扁平上皮（外胚層）、軟骨（中胚層）以及腸腺上皮（內(nèi)胚層）；胚胎干細(xì)胞克隆集落體外懸浮培養(yǎng)14天后形成擬胚體狀結(jié)構(gòu)。 結(jié)論臨床上D3低質(zhì)量胚胎經(jīng)囊胚序貫培養(yǎng)可以形成囊胚；低質(zhì)量冷凍囊胚經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)接種后可以形成胚胎干細(xì)胞原代集落；低質(zhì)量冷凍來源的胚胎干細(xì)胞原代集落可以成功接種傳代并保持經(jīng)典胚胎干細(xì)胞特性；臨床上低質(zhì)量廢棄胚胎可以成功序貫培養(yǎng)出囊胚并進(jìn)行胚胎干細(xì)胞建系研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R714.8

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2289856