發(fā)布時(shí)間：2018-10-23 14:43

【摘要】：盆腔器官脫垂(pelvic floor prolapse，POP)是中老年婦女的常見病疾之一，中重度POP可以嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量并造成巨大的心理負(fù)擔(dān)，臨床上亟需有效的治療方法。盆底重建手術(shù)是治療中重度POP最重要的手術(shù)方式。傳統(tǒng)POP修復(fù)術(shù)式主要是在已經(jīng)受損或有異常膠原生成的薄弱盆底組織(筋膜、結(jié)締組織及韌帶)上進(jìn)行手術(shù)修補(bǔ)，無法從根本上解決組織缺陷的疾病本質(zhì)，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，因此臨床上亟需更為安全穩(wěn)定的修補(bǔ)材料(作為盆底薄弱組織的有效替代)來改進(jìn)手術(shù)方式，從而提高POP手術(shù)治療的效果。 近年來，生物組織工程技術(shù)發(fā)展十分迅速，生物工程組織替代材料作為薄弱或受損盆底的支持物可更好的用于盆底正常解剖結(jié)構(gòu)的重建，達(dá)到恢復(fù)盆底正常支持功能的目的。聚丙烯網(wǎng)片(polypropylene mesh，PM)作為一種合成網(wǎng)片在盆底重建手術(shù)中應(yīng)用較為廣泛，但易發(fā)生感染、攣縮、排異、慢性疼痛、性交困難等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者術(shù)后的生活質(zhì)量。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)具有良好的組織相容性，，在植入體內(nèi)后可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，促進(jìn)Th1細(xì)胞（免疫排斥）向Th2細(xì)胞（免疫耐受）及M1型巨噬細(xì)胞（促炎癥和細(xì)胞毒性）向M2型巨噬細(xì)胞（抗炎和組織修復(fù)）的轉(zhuǎn)變。豬脫細(xì)胞后的膀胱基質(zhì)(urinary bladder matrix，UBM)屬于ECM的一種，來源便捷，生產(chǎn)成本較低，是目前生物材料研究范疇的熱點(diǎn)之一，其缺點(diǎn)是植入體內(nèi)后降解較快。來源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)屬于多能干細(xì)胞的一種，來源豐富且具有多向分化潛能，是組織工程常用的種子細(xì)胞之一。BMSCs作為一種修復(fù)干細(xì)胞，在一定的生物微環(huán)境中可分化為具有與周圍組織相似的功能細(xì)胞，參與到受損部位的組織修復(fù)。同時(shí)，BMSCs在體內(nèi)外表現(xiàn)出顯著的抗炎癥和免疫抑制的作用。本研究采用聯(lián)合物理與化學(xué)的方法制備豬脫細(xì)胞UBM，并采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，利用組織工程學(xué)的原理將培養(yǎng)的BMSCs接種于UBM-PM支架上，構(gòu)建了BMSCs-UBM-PM復(fù)合網(wǎng)片。同時(shí)，觀察BMSCs-UBM-PM植入大鼠腹部皮下后引起的組織病理學(xué)變化、炎癥反應(yīng)、免疫耐受情況，并行力學(xué)性能檢測，探討其用作盆底修復(fù)和重建候選替代材料的可行性。 一、實(shí)驗(yàn)方法 1、豬脫細(xì)胞UBM的制備 本研究對豬膀胱采用去污劑洗滌、攪拌、酶消化法進(jìn)行脫細(xì)胞處理，制備UBM。掃描電鏡觀察凍干UBM形態(tài)。取UBM標(biāo)本常規(guī)石蠟切片后行HE及DAPI染色觀察脫細(xì)胞效果，堿水解法測定UBM標(biāo)本中羥脯氨酸的含量，分子生物學(xué)方法測定UBM標(biāo)本中的DNA濃度。 2、大鼠BMSCs的分離、鑒定其在UBM上的生長及增殖研究 采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，腺病毒(攜帶有GFP基因片段)感染SD大鼠BMSCs。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子CD29、 CD44、CD31、CD45，成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)試劑盒檢測BMSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、掃描電鏡觀察BMSCs在UBM上的生長、增殖情況。 3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)-聚丙烯復(fù)合網(wǎng)片在大鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究 SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只，根據(jù)預(yù)植入材料的不同，分別命名為BMSCs-UBM-PM組(PM夾于負(fù)載有BMSCs的雙層UBM之間)、UBM-PM組(PM夾于未負(fù)載BMSCs的雙層UBM之間)、PM組(單純PM)和假手術(shù)(sham-operated，S)組。手術(shù)后第1、2、4、6周分批處死大鼠，取材行HE染色、Masson染色、免疫組化染色、免疫熒光染色和力學(xué)測試。 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.經(jīng)脫細(xì)胞處理后的膀胱未見明顯的細(xì)胞成分殘留，可見均質(zhì)狀態(tài)的基質(zhì)和呈網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)改變膠原纖維。凍干后的UBM干燥、質(zhì)地堅(jiān)韌，抗張力強(qiáng)度高，延展性下降。掃描電鏡下可見膠原纖維排列整齊、均勻，紋理較粗，呈條索狀改變。脫細(xì)胞前UBM中的平均羥脯氨酸含量為2.45μg/mg，脫細(xì)胞后UBM中的平均羥脯氨酸含量為2.34μg/mg，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。UBM中的平均DNA濃度由脫細(xì)胞前的443.71μg/ml降為脫細(xì)胞后的4.32μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 2.全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，24h觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞部分貼壁，48h觀察發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞分裂增殖，呈梭形或多邊形，細(xì)胞傳代3次形態(tài)上無較大改變。BMSCs表達(dá)CD29的陽性率為98.74%、CD44的陽性率為95.43%、CD31的陽性率為2.03%、CD45的陽性率為1.14%。成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)BMSCs后油紅O、茜素紅及阿利新藍(lán)染色均呈陽性，腺病毒(攜帶有GFP基因片段)能成功感染BMSCs。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)提示BMSCs在UBM上生長良好，增殖能力較強(qiáng)。掃描電鏡下見BMSCs在UBM上呈梭形或多邊形生長。 3.BMSCs-UBM-PM組炎癥細(xì)胞浸潤少且膠原纖維、新生血管較多。免疫熒光示BMSCs可在體內(nèi)至少存活6周，部分可分化為平滑肌細(xì)胞。免疫組化結(jié)果提示BMSCs-UBM-PM在各周的CXCR3（Th1細(xì)胞表面標(biāo)志）陽性比例均低于其他各組，而PM在各周的CXCR3陽性比例均高于其他各組。UBM-PM的CXCR3陽性比例介于兩者之間。BMSCs-UBM-PM和UBM-PM的CCR4（Th2細(xì)胞表面標(biāo)志）陽性比例在第2周達(dá)到最高，而PM的CCR4陽性比例在各周均處于較低水平。力學(xué)測試顯示，BMSCs-UBM-PM組最大負(fù)荷(kN)為0.31±0.08，最大張力(mm/mm)為0.62±0.19，楊氏模數(shù)(MPa)為43.36±11.83，均顯著高于其他組測試結(jié)果。 三、主要結(jié)論 1.聯(lián)合物理與化學(xué)的方法進(jìn)行脫細(xì)胞處理，制備的UBM有良好的組織相容性，膠原蛋白丟失較少，消毒、凍干后易于儲(chǔ)存，是一種較為理想的組織工程、盆底修復(fù)和替代用生物支架材料。 2.全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)所得的SD大鼠BMSCs純度高，活性好，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，可作為組織工程用的種子細(xì)胞。 3. BMSCs-UBM-聚丙烯復(fù)合網(wǎng)片與傳統(tǒng)的聚丙烯補(bǔ)片相比，植入大鼠體內(nèi)后引起的炎癥反應(yīng)弱，可誘導(dǎo)移植耐受，有良好的生物相容性和較強(qiáng)的組織張力，因此該復(fù)合網(wǎng)片可作為修復(fù)和重建盆底組織理想的候選替代材料。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R711.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2289548