【摘要】：第一部分孕中期高風(fēng)險胎兒異常染色體分布的研究 內(nèi)容12001-2010年浙江省高風(fēng)險胎兒的羊水染色體核型分布研究 研究目的： 了解浙江省孕中期高風(fēng)險胎兒的染色體異常分布情況 研究方法： 回顧收集2001-2010年在本中心進行產(chǎn)前診斷的12841例羊水染色體核型結(jié)果,按21三體高風(fēng)險、18三體高風(fēng)險、高齡、不良妊娠史、異常家族史、胎兒超聲異常、其它等7組產(chǎn)前診斷適應(yīng)證,對染色體異常核型進行分組分析,根據(jù)是否有顯著臨床意義將染色體異常結(jié)果分成高風(fēng)險染色體異常和低風(fēng)險染色體異常。分析胎兒染色體異常檢出率、主要的高風(fēng)險染色體異常種類。 結(jié)果： 12841例羊水中檢出染色體異常核型462例(3.60%),高、低風(fēng)險染色體異常的檢出率分別為1,67%和1.92%。不同的適應(yīng)證中檢出的高風(fēng)險染色體異常比例不同,“胎兒超聲異常”指證的高風(fēng)險染色體異常檢出率最高,達27.27%。在所有適應(yīng)證中,檢出的21三體、1.8三體、13三體(T21/18/13)占所有高風(fēng)險染色體異常的72.56%,檢出的21、18、13、X、Y等五種染色體數(shù)目異常(21/18/13/X/Y組合)占所有高風(fēng)險染色體異常的94.88%。在21三體高風(fēng)險、18三體高風(fēng)險、高齡和胎兒超聲異常等常見產(chǎn)前診斷適應(yīng)證中,T21/18/13組合分別占高風(fēng)險染色體異常的78.13%、92.59%、66.07%和54.17%；21/18/13/X/Y組合分別占高風(fēng)險染色體異常的95.83%、96.30%、94.64%和95.83%。 結(jié)論： 21/18/13/X/Y組合約占胎兒高風(fēng)險染色體異常的95%,是產(chǎn)前診斷的主要對象；不同適應(yīng)證檢出的高風(fēng)險染色體異常有差異,臨床應(yīng)根據(jù)具體適應(yīng)證選擇適宜的診斷技術(shù)。 內(nèi)容2中國多中心2001-2010高齡孕婦羊水染色體的核型分布研究 研究目的： 了解高齡指證的變化趨勢以及高齡孕婦羊水染色體異常分布情況 研究方法： 研究數(shù)據(jù)來源于全國13家產(chǎn)前診斷中心,涉及病例為2001年1月至2010年12月期間在各中心因單一高齡因素就診的孕婦46258例,按孕婦預(yù)產(chǎn)期年齡將高齡孕婦分為35歲組、36歲組、37歲組、38歲組、39歲組、40歲及以上組等7組,對高風(fēng)險染色體異常進行分組分析。 結(jié)果： 從2001年到2010年,“高齡”占所有產(chǎn)前診斷適應(yīng)證的比例已從20%上升到46%；在46258例高齡孕婦羊水染色體中檢出708例高風(fēng)險染色體異常(1.53%),其中,21三體、18三體、13三體(T21/18/13)占所有高風(fēng)險染色體異常的73.59%,21、18、13、X、Y等五種染色體數(shù)目異常(21/18/13/X/Y組合)占所有高風(fēng)險染色體異常的93.93%,罕見染色體異常(包括染色體部分缺失或增加、不平衡易位等)占高風(fēng)險染色體異常的6.07%。T21/18/13組合和21/18/13/X/Y組合在35、36、37、38組的檢出率無顯著差異((P=0.133),自39歲組開始有顯著增高(P0.001),在39及以上組中,T21/18/13、21/18/13/X/Y組合的檢出率分別占該組高風(fēng)險染色體異常的77.35%和96.86%；罕見染色體異常檢出率與年齡關(guān)系不顯著,在高風(fēng)險染色體異常中的比例隨年齡增加而降低。 結(jié)論： 高齡妊娠產(chǎn)前診斷需求在持續(xù)上升,染色體核型診斷壓力加大；21/18/13/X/Y組合是該指證產(chǎn)前診斷的主要對象,占所有高齡孕婦中胎兒高風(fēng)險染色體異常的93.93%,其檢出率在39歲后隨年齡增加而顯著增高。上述數(shù)據(jù)為選擇適宜產(chǎn)前診斷技術(shù)提供了依據(jù)。 第二部分中國漢族人群STR群體遺傳學(xué)研究與高通量STR檢測技術(shù)建立 研究目的： 從大樣本人群中獲取中國漢族人群STR的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)；建立高通量STR檢測技術(shù)。 研究對象與研究樣本： 研究對象是21號、18號、13號和性染色體上的44個候選STR基因座以及TAF9b、性別基因Amelogenin (AMEL)、SRY;研究樣本包括500例以上中國漢族非親緣關(guān)系個體的全血樣本；高風(fēng)險孕婦羊水樣本558例；42例絨毛樣本。 研究方法： 1)高通量STR檢測技術(shù)建立的準(zhǔn)備工作：采用PRIMER3對所有44個候選STR與基因TAF9b、AMEL、SRY進行引物設(shè)計；采用5'ROX、5'TAMRA、5'HEX、6'FAM等熒光標(biāo)記優(yōu)選的引物；優(yōu)化STR-PCR擴增體系的組分；采用Chelex方法提取樣本DNA；將所有基因座分別納入D21、1318XY和1318XYplus等3個STR-PCR體系,對500例以上中國漢族非親緣關(guān)系個體的樣本DNA進行擴增,在ABI3130毛細(xì)管電泳儀上進行擴增產(chǎn)物檢測,分析STR檢測情況以及基因型,初步建立41個STR的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。 2)建立D21高通量STR檢測體系(D21體系)與STR群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)：挑選21號染色體上11個STR(D21S1432、D21S11、D21S1246、D21S1412、D21S1437、 D21S1413、D21S2039、D21S1270、D21S1435、D21S1446、D21S1409)與Amel基因組成D21體系,建立常見等位基因的標(biāo)準(zhǔn)品(Allelic Ladder),編制D21體系等位基因分型軟件,基于500例以上樣本基因型檢測和等位基因序列分析,建立中國漢族人群21號染色體上11個STR的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)；用D21體系檢測558例羊水樣本以及42例絨毛樣本,確定21號染色體數(shù)目診斷標(biāo)準(zhǔn),以染色體核型為對照,驗證D21體系對21三體的診斷符合度。 3)建立D1318XY高通量STR檢測體系(D1318XY體系)：挑選13號、18號、X、Y染色體上的19個STR (D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、 D13S305、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634、D18S390、 D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、D18S391、X22、D18S499)與TAF9b、 Amel、SRY組成檢測22個基因座的D1318XY體系,建立常見Allelic Ladder,編制D1318XY體系等位基因分型軟件,用D1318XY體系檢測558例羊水樣本以及42例絨毛樣本,以染色體核型為對照,確定13號、18號和性染色體X、Y等4種染色體數(shù)目的診斷標(biāo)準(zhǔn),驗證D1318XY體系對上述4種染色體數(shù)目異常的診斷符合度。 結(jié)果： 建立了能同時檢測12個基因座的D21體系和22個基因座的D1318XY體系,在558例羊水樣本和42例絨毛樣本中檢測出了所有的目標(biāo)染色體數(shù)目異常：21三體、18三體、13三體、性染色體數(shù)目異常等。建立了中國漢族人群21號染色體上11個STR的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)�；�500例以上非親緣關(guān)系個體樣本的檢測,從30個STR(D21體系和D1318XY體系)中發(fā)現(xiàn)D21S1412、D21S1270、D21S11、 D21S1442、D18S535、D18S386、D18S1002、D18S499、D18S977、D21S305.D21S634. D13S258、D13S74213、DXS1187、DXS6809、DXS6807、DXYS267、X22、DXYS218等基因座具有相對較高的雜合度,可優(yōu)選用于QF-PCR技術(shù)研究。 結(jié)論： 成功建立了兩個高通量STR檢測體系(D21體系和D1318XY體系),為后續(xù)的QF-PCR研究提供了技術(shù)支撐；建立了中國漢族人群在21號、18號、13號和性染色體上41個STR的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù),為挑選QF-PCR適宜STR基因座提供了依據(jù)。 第三部分中國人群QF-PCR檢測技術(shù)的建立 研究目的： 建立中國漢族人群QF-PCR檢測技術(shù) 研究樣本： 羊水558例(有胎兒染色體核型分析結(jié)果)；15例絨毛樣本(有FISH結(jié)果)；部分胚胎或胎兒的生物學(xué)父母的全血；少量血斑、帶毛囊毛發(fā)、唾液斑、肌肉組織等標(biāo)本。 研究方法： 挑選21號、18號、13號和性染色體上的21個STR (D21S1432、D21S1270、 D21S11、D21S1412、D21S1442、D21S1435、D18S535、D18S386、D18S1002、 D18S977、D18S499、D13S305、D13S634、D13S258、D13S742、DXS1187、DXYS218、 DXYS267、DXS981、DXS6809、X22)與AMEL、SRY共23個基因座重新建立高通量STR檢測體系(即QF-PCR):設(shè)計各基因座排布；采用PRIMER3對所有21個STR與基因AMEL、SRY重新設(shè)計引物；采用5'ROX、5'TAMRA、5'HEX、6'FAM等熒光標(biāo)記優(yōu)選的引物；優(yōu)化STR-PCR擴增體系的組分；建立常見等位基因的標(biāo)準(zhǔn)品(Allelic Ladder),編制等位基因分型軟件；采用梯度DNA標(biāo)準(zhǔn)品9947A檢測QF-PCR的靈敏度；采用不同比例混合的DNA標(biāo)準(zhǔn)品(已知基因型)9947A和9948檢測QF-PCR對混合樣本基因型的識別能力；用QF-PCR檢測血液、血斑、羊水、組織等不同標(biāo)本類型；評估QF-PCR檢測時間與檢測通量；以染色體核型或FISH結(jié)果為對照,基于558例羊水樣本以及15例絨毛樣本的檢測,驗證前期建立的目標(biāo)染色體數(shù)目診斷標(biāo)準(zhǔn),評估QF-PCR對目標(biāo)染色體異常的診斷符合度；對部分QF-PCR檢測為異常染色體的胚胎或胎兒樣本,增加其父源和母源的樣本檢測,驗證多余或缺失染色體的親緣來源。 結(jié)果： 所建立的QF-PCR技術(shù)包含23個基因座,能同時檢測21、13、18、X、Y等5種染色體的數(shù)目異常；所建立的QF-PCR性能良好：檢測靈敏度高、準(zhǔn)確、快速、高通量、適用于多種標(biāo)本類型、可檢測出占比20%以上的混合樣本的基因型,并可拓展用于異常染色體核型來源的分析。樣本檢測中發(fā)現(xiàn)有灰區(qū)和單基因座異常的情況,需要擴大樣本研究。 結(jié)論： 本部分研究成功建立了適用于中國人群的QF-PCR技術(shù)。 第四部分中國人群QF-PCR技術(shù)臨床應(yīng)用的前瞻性研究 研究目的： 了解所建立QF-PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用“適宜”性。 研究方法： 2012年1月-2014年6月期間,收集我院進行羊水產(chǎn)前診斷的剩余羊水925例(不含肉眼可見的新鮮血性羊水),每例2-3ml。檢測時取羊水lml,用Chelex方法提取,每批同時檢測90個樣本,采用建立的QF-PCR體系進行單盲檢測,在普通PCR儀上進行擴增,在ABl3130型遺傳分析儀上進行毛細(xì)管電泳和基因型分析。評估檢測成功率、準(zhǔn)確性、檢測時間與通量、檢測可及性等。 結(jié)果： 925例羊水樣本全部檢測成功。與核型結(jié)果比較,QF-PCR檢出了16例目標(biāo)染色體異常中的15例：21三體8例、18三體3例、13三體1例、45X1例、47XXY1例和47XXX1例。漏診1例45X嵌合體(核型：46,XX[46]/45,X[4])。QF-PCR與染色體核型對5種染色體異常的檢測總一致性為：99.89%(95%CI99.78-100%)；陽性檢測一致性為93.75%(95%CI92.95-94.55%)；陰性檢測一致性為100%。QF-PCR可批量檢測,每例樣本平均檢測時間16-17min；QF-PCR檢測在PCR實驗室即可進行。 結(jié)論： 所建立的QF-PCR技術(shù)是中國人群“適宜”的產(chǎn)前診斷技術(shù),臨床應(yīng)用中具有快速、準(zhǔn)確、高通量、應(yīng)用方便、價格低廉、質(zhì)控方便等優(yōu)越性,有很好的應(yīng)用前景。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊文娟;吳青青;王莉;李蔓;;胎兒超聲軟標(biāo)記、結(jié)構(gòu)畸形與染色體異常的相關(guān)性研究[J];中華醫(yī)學(xué)超聲雜志(電子版);2011年01期

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本文編號：2263192