【摘要】：研究背景和目的隨著生育年齡的推后,環(huán)境污染和生活壓力增大,不孕癥的發(fā)生率呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì)。近年來(lái),體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)及其相關(guān)的衍生技術(shù)快速發(fā)展及其在臨床的廣泛應(yīng)用使得眾多不孕不育患者有機(jī)會(huì)獲得了后代。IVF-ET成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是胚胎的成功著床。輔助生殖中總體妊娠率徘徊在40%-60%[1]左右,但是不少夫婦反復(fù)多次助孕后仍然失敗,經(jīng)濟(jì)和精神都受到巨大的壓力,臨床醫(yī)生也沮喪不已。2005年從Thomhill提出反復(fù)著床失敗(repeated implantation failure,RIF)[2]的定義到后來(lái) Margaliothle等學(xué)者提出還需考慮胚胎期別和患者年齡[3],至今大多數(shù)學(xué)者采用的RIF定義是:移植3次以上優(yōu)質(zhì)胚胎或者多次移植胚胎數(shù)量共計(jì)≥ 10枚后仍未能獲得臨床妊娠。RIF已經(jīng)成為輔助生殖中提高妊娠率的瓶頸問(wèn)題,如何改善這類不孕患者的助孕結(jié)局,提高胚胎著床的成功率成為了我們亟待解決的問(wèn)題。南方醫(yī)院生殖中心體外受精-胚胎移植的反復(fù)著床失敗的發(fā)生率約為7～11%[4],全松等認(rèn)為原因有如下幾個(gè)方面:胚胎質(zhì)量不良、移植技術(shù)缺陷、子宮內(nèi)膜容受性不良、精神心理因素及不明原因。其中約2/3的反復(fù)著床失敗是由于子宮內(nèi)膜容受性不良導(dǎo)致的[5,6]。因此,研究改善如何圍著床期子宮內(nèi)膜的容受性及其相關(guān)機(jī)制,成為了反復(fù)著床失敗的研究熱點(diǎn),對(duì)于提高RIF助孕患者的妊娠率具有重要的意義。人類育齡期婦女的生殖系統(tǒng)存在生理性血管生成,對(duì)生殖系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育和基本功能的至關(guān)重要[7,8],而既往對(duì)子宮內(nèi)膜組織學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),圍著床期過(guò)程中子宮內(nèi)膜局部生理性血管新生活動(dòng)處于高峰是圍著床期生殖系統(tǒng)發(fā)生的最顯著性標(biāo)志之一。巨噬細(xì)胞是一種古老的免疫細(xì)胞,在固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中都起著關(guān)鍵性的作用,是炎性反應(yīng)中主要的調(diào)節(jié)細(xì)胞[9]。巨噬細(xì)胞功能廣泛,有經(jīng)典免疫學(xué)中的吞噬作用、抗原提呈作用以及殺菌作用,還能分泌多種細(xì)胞因子在不用的組織內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生不同的作用[10-12]。近年來(lái),有學(xué)者發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞除了經(jīng)典的免疫功能外,還有著一些新的功能例如促進(jìn)血管形成和血管重建等[13],提示巨噬細(xì)胞也可能參與胚胎著床的發(fā)生。本課題前期研究運(yùn)用了大鼠NR8383巨噬細(xì)胞株進(jìn)行研究表明PGE2是通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞生成VEGF,并且可能進(jìn)而調(diào)控其對(duì)血管新生的活動(dòng)[14]。但是人巨噬細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題選取THP-1巨噬細(xì)胞及其促血管新生的作用作為切入點(diǎn),通過(guò)研究THP-1巨噬細(xì)胞如何上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表達(dá)及其調(diào)控的機(jī)制探討其相關(guān)的促血管生成作用,為RIF的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一章PGE2上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞VEGF表達(dá)的機(jī)制研究第一節(jié)PGE2上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞VEGF表達(dá)目的:為了研究在女性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的巨噬細(xì)胞是可能通過(guò)何種機(jī)制調(diào)節(jié)促血管生成的作用,我們采用了 THP-1巨噬細(xì)胞進(jìn)行了體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),通過(guò)Western Blot的方法檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)促血管生成因子VEGF蛋白表達(dá)水平,初步探討PGE2能否促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞合成VEGF的表達(dá)。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)選取生長(zhǎng)良好的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞,PMA誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁形成典型的巨噬細(xì)胞即為THP-1巨噬細(xì)胞。2.Westernblotting檢測(cè)PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的影響。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細(xì)胞,分組為:空白處理組、1μmol/LPGE2組、10μmol/LPGE2組,處理THP-1巨噬細(xì)胞24小時(shí)后,提取細(xì)胞全蛋白,Western Blot分析VEGF蛋白的表達(dá)。3.SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多樣本均數(shù)比較應(yīng)用方差分析,方差齊選用LSD方法,方差不齊則用Duimett T3法,結(jié)果:與空白對(duì)照組相比,1μmol/LPGE2組THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)的VEGF蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05);與與空白對(duì)照組相比,10μmol/LPGE2組THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)的VEGF蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05);與1μmol/LPGE2組相比,10μmol/L PGE2組THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)的VEGF蛋白表達(dá)亦有明顯升高(P0.05)。結(jié)論:PGE2能有效上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白的表達(dá)。并且,PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用與呈濃度-梯度效應(yīng)。第二節(jié)PGE2上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞VEGF表達(dá)的通路研究目的:采用了 PGE2的特異性受體拮抗劑(EP2拮抗劑AH6809或EP4拮抗劑AH23848)或cAMP-PKA通路的特異性抑制劑(腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536或PKA抑制劑H89)預(yù)處理后再予PGE2刺激THP-1巨噬細(xì)胞,通過(guò)Western Blot的方法檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步探討PGE2調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞合VEGF表達(dá)的機(jī)制。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)選取生長(zhǎng)良好的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞,PMA誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁形成典型的巨噬細(xì)胞即為THP-1巨噬細(xì)胞。2.Westemblotting檢測(cè)PGE2上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的通路研究。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細(xì)胞,予PGE2的特異性受體拮抗劑(EP2拮抗劑AH6809或EP4拮抗劑AH23848)預(yù)處理后再予PGE2刺激THP-1巨噬細(xì)胞,提取細(xì)胞全蛋白,Western Blot分析VEGF蛋白的表達(dá)。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細(xì)胞,予cAMP-PKA通路的特異性抑制劑(腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536或PKA抑制劑H89)預(yù)處理后再予PGE2刺激THP-1巨噬細(xì)胞,提取細(xì)胞全蛋白,Western Blot分析VEGF蛋白的表達(dá)。3.SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多樣本均數(shù)比較應(yīng)用方差分析,方差齊選用LSD方法,方差不齊則用Duimett T3法,P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:EP2拮抗劑能抑制PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的上調(diào)作用,而EP4則無(wú)影響。腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536和PKA抑制劑H89均能抑制PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。結(jié)論:PGE2是通過(guò)EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白的表達(dá)。第二章PGE2增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)體外血管新生的影響第一節(jié)PGE2影響THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs的遷移能力目的:上述實(shí)驗(yàn)初步證明了 PGE2通過(guò)EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá),從而提示了 PGE2可能是通過(guò)上調(diào)了 THP-1巨噬細(xì)胞株的VEGF表達(dá)從而增強(qiáng)其促血管生成作用。因此我們采用了體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)—Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel體外成管實(shí)驗(yàn),予不同處理THP-1巨噬細(xì)胞后,取細(xì)胞培養(yǎng)上清處理HUVECs,觀察HUVECs遷移的數(shù)目,驗(yàn)證PGE2是否可以影響THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs的遷移能力以及其影響的可能機(jī)制。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)選取生長(zhǎng)良好的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞,PMA誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁形成典型的巨噬細(xì)胞即為THP-1巨噬細(xì)胞。2.體外血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株促進(jìn)HUVECs遷移能力的影響。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細(xì)胞,分組為:空白處理組:不予任何處理1 μmol/L PGE2 組:1μmol/L PGE2 處理 THP-1 巨噬細(xì)胞 24h 10μmol/L PGE2組:10μmol/L PGE2 處理 THP-1 巨噬細(xì)胞 24hAH6809+ PGE2 組:10μmol/L AH6809 預(yù)處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細(xì)胞23hAH23848+ PGE2 組:10μmol/L AH23848 預(yù)處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細(xì)胞23hSQ22536+ PGE2 組:30μmol/L SQ22536 預(yù)處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細(xì)胞23hH89++ PGE2 組:10μmol/L H89 預(yù)處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理 THP-1巨噬細(xì)胞23h上述各組處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清棄去,PBS洗滌細(xì)胞后繼續(xù)無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基裴洋8h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清處理HUVECs,分別以Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察不同處理下HUVECs遷移數(shù)目差異,從而研究PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株促進(jìn)體外血管生成的影響3.SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多樣本均數(shù)比較應(yīng)用方差分析,方差齊選用LSD方法,方差不齊則用Duimett T3法,結(jié)果:與空白對(duì)照組相比,1μmol/LPGE2組HUVECs遷移數(shù)目增多(P0.05);與空白對(duì)照組相比,10μmol/LPGE2組HUVECs遷移數(shù)目也明顯增多(P0.05);與 1 μmol/LPGE2 組相比,10μmol/LPGE2 組 HUVECs 遷移數(shù)目增多(P0.05);AH6809+ PGE2 組的 HUVECs 遷移數(shù)目較10μmol/L PGE2 組的少(P0.05),AH23848+ PGE2的HUVECs遷移數(shù)目與10μmol/LPGE2組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;SQ22536+ PGE2 組和 H89++ PGE2 組的 HUVECs 遷移數(shù)目與10μmol/LPGE2 組相比均減少(P0.05)。結(jié)論:1.PGE2處理THP-1巨噬細(xì)胞能增強(qiáng)HUVECs遷移能力。PGE2處理THP-1巨噬細(xì)胞后,能明顯增強(qiáng)HUVECs遷移的能力。其增強(qiáng)的能力與PGE2呈濃度-梯度效應(yīng),這與Westemblot的結(jié)果相一致。2.PGE2處理THP-1巨噬細(xì)胞能增強(qiáng)HUVECs遷移能力的機(jī)制。EP2拮抗劑AH6809、腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536和PKA抑制劑H89均能抑制PGE2增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞能促進(jìn)HUVECs遷移能力,提示PGE2通過(guò)EP2和cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞增強(qiáng)HUVECs的遷移能力。第二節(jié)PGE2影響THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs的體外成管能力目的:上述實(shí)驗(yàn)初步證明了 PGE2通過(guò)EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá),從而提示了 PGE2可能是通過(guò)上調(diào)了 THP-1巨噬細(xì)胞株的VEGF表達(dá)從而增強(qiáng)其促血管生成作用。因此我們采用了 Matrigel體外成管實(shí)驗(yàn),予不同處理THP-1巨噬細(xì)胞后,取細(xì)胞培養(yǎng)上清處理HUVECs,觀察HUVECs的體外成管面積,驗(yàn)證PGE2是否可以影響THP-1巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs的體外成管能力以及其影響的可能機(jī)制。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)選取生長(zhǎng)良好的人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞,PMA誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁形成典型的巨噬細(xì)胞即為THP-1巨噬細(xì)胞。2.體外血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株促進(jìn)HUVECs體外成管能力的影響。選取狀態(tài)良好的THP-1巨噬細(xì)胞,分組為:空白處理組:不予任何處理11μmol/LPGE2 組:1μmol/LPGE2 處理 THP-1 巨噬細(xì)胞 24h 1 0μmol/L PGE2 組:1 0μmol/L PGE2 處理 THP-1 巨噬細(xì)胞 24hAH6809+ PGE2 組:10μmol/L AH6809 預(yù)處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細(xì)胞23hAH23848+ PGE2 組:10μmol/L AH23848 預(yù)處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細(xì)胞23hSQ22536+ PGE2 組:30μmol/L SQ22536 預(yù)處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理THP-1巨噬細(xì)胞23hH89++ PGE2 組:10μmol/L H89 預(yù)處理 1h 后加 10μmol/L PGE2 處理 THP-1巨噬細(xì)胞23h上述各組處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清棄去,PBS洗滌細(xì)胞后繼續(xù)無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基裴洋8h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清HUVECs,分別以Matrigel實(shí)驗(yàn)觀察不同處理下HUVECs體外成管面積的差異,從而研究PGE2對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞株促進(jìn)體外血管生成的影響。3.SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多樣本均數(shù)比較應(yīng)用方差分析,方差齊選用LSD方法,方差不齊則用Duimett T3法,結(jié)果:與空白對(duì)照組相比,1μmol/LPGE2組HUVECs成管面積增大(P0.05);與空白對(duì)照組相比,10μmol/LPGE2組HUVECs成管面積增大(P0.05);與1μmol/L PGE2組相比,10μmol/L PGE2組HUVECs成管面積也明顯增大(P0.05);AH6809+ PGE2 組的 HUVECs 成管面積較 10μmol/L PGE2 組的小(P0.05),AH23848+ PGE2的HUVECs成管面積與10μmol/L PGE2組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;SQ22536+ PGE2組和H89+ PGE2組的HUVECs遷移數(shù)目與10μmol/L PGE2組相比均減小(P0.05)。結(jié)論:1.PGE2處理THP-1巨噬細(xì)胞能增強(qiáng)HUVECs體外成管能力。PGE2處理THP-1巨噬細(xì)胞后,能明顯增強(qiáng)HUVECs體外成管的能力。其增強(qiáng)的能力與PGE2呈濃度-梯度效應(yīng),這與Westemblot的結(jié)果相一致。2.PGE2處理THP-1巨噬細(xì)胞能增強(qiáng)HUVECs體外成管能力的機(jī)制。EP2拮抗劑AH6809、腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536和PKA抑制劑H89均能抑制PGE2增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞能促進(jìn)HUVECs體外能力,這和Westemblot的結(jié)果以及Transwell的結(jié)果相一致,因此證明PGE2通過(guò)EP2-cAMP-PKA通路調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞株VEGF蛋白表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)血管生成功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2250689