【摘要】：近年來的研究認(rèn)為宮腔粘連(IUA)的發(fā)生可能與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞減少、缺失或功能障礙有關(guān),所以提出利用干細(xì)胞移植來治療IUA。最新的研究認(rèn)為月經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(MenSCs)是更適合用作細(xì)胞治療的種子細(xì)胞,因?yàn)榕c骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比,除具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)外還具有更快的增殖能力、能分化為三個(gè)胚層的多種組織和高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白等特點(diǎn),可能與其表達(dá)胚胎干細(xì)胞(ESCs)抗原OCT-4而具有ESCs的部分特性有關(guān)。本研究致力于運(yùn)用MenSCs移植治療嚴(yán)重IUA患者的臨床前研究,終極目標(biāo)是恢復(fù)IUA患者子宮內(nèi)膜的生育功能。主要內(nèi)容分為以下幾個(gè)部分,第一部分分離、培養(yǎng)和鑒定月經(jīng)血中子宮內(nèi)膜干細(xì)胞,為干細(xì)胞移植治療宮腔粘連提供細(xì)胞來源；第二部分體外誘導(dǎo)MenSCs向子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化,為干細(xì)胞治療宮腔粘連提供理論依據(jù)；第三部分MenSCs移植于NOD-SCID小鼠腎包膜下或皮下,經(jīng)雌激素治療后證實(shí)MenSCs在體內(nèi)可以重建子宮內(nèi)膜組織；第四部分調(diào)查宮腔鏡下診斷為重度宮腔粘連者月經(jīng)血及子宮內(nèi)膜組織中干細(xì)胞,并與有正常生育史的宮腔正常者的比較,確定IUA患者子宮內(nèi)膜干細(xì)胞減少或缺失,說明用干細(xì)胞移植治療IUA是必要的。結(jié)果：1)MenSCs在含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)呈克隆性生長,顯示了干細(xì)胞的生長特性。運(yùn)用流式細(xì)胞分析技術(shù)分析培養(yǎng)的經(jīng)血源性干細(xì)胞中OCT-4陽性細(xì)胞率為95.13%±0.81%,CD45為0.93%±0.42%,STRO-1為1.80%±0.92%,HLA-DR為1.00%±0.35%,說明培養(yǎng)所得的細(xì)胞基本為OCT-4*干細(xì)胞,且免疫原性低下,倍增24次細(xì)胞染色體核型仍保持正常。2)培養(yǎng)后的MenSCs在條件培養(yǎng)基和17β-戊酸雌二醇共同作用下能夠在體外被誘導(dǎo)向子宮內(nèi)膜細(xì)胞方向分化,運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞角蛋白CK、間質(zhì)細(xì)胞波形蛋白VIM,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后CK、VIM陽性率明顯強(qiáng)于誘導(dǎo)前,并且CK、VIM的mRNA水平和蛋白表達(dá)量較誘導(dǎo)前均明顯增加,(p0.05),說明MenSCs在體外可以誘導(dǎo)分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞。3)培養(yǎng)的MenSCs移植于垂體降調(diào)節(jié)去勢的雌性NOD/SCID小鼠的腋窩皮下,經(jīng)雌激素治療后組織病理檢查和免疫組織化學(xué)檢測CK、VIM、PR、ER和CD31,發(fā)現(xiàn)HE染色下可見腺體樣結(jié)構(gòu),免疫組織化學(xué)檢測CK、VIM和PR有表達(dá),ER和CD31沒有表達(dá),證實(shí)了MenSCs在體內(nèi)可以重建子宮內(nèi)膜組織。CD31不表達(dá)說明了重建的過程中子宮內(nèi)膜組織的血供可能是來自宿主的。4)宮腔鏡下診斷為宮腔粘連者較有生育史宮腔正常者M(jìn)enSCs培養(yǎng)后克隆形成率顯著降低((0.74±0.11)×10-6vs(6.8±0.56)×10-6,p0.001),粘連部位的內(nèi)膜組織干細(xì)胞(EnSCs)培養(yǎng)后克隆形成率較宮腔正常者克隆形成率顯著降低(0 vs1.21%±0.04%,p0.001),粘連部位旁疑似正常組織的EnSCs培養(yǎng)后較宮腔正常者克隆形成率也顯著降低(0.14%±0.03%vs 1.21%±0.04%)。免疫組織化學(xué)檢測宮腔粘連者OCT-4陽性細(xì)胞比例顯著低于正常宮腔者(0.1%vs 2%),CD146陽性細(xì)胞比例(0.5% vs 1%),正常者子宮內(nèi)膜功能層CD31陽性細(xì)胞數(shù)為1%,基底層為2%,而宮腔粘連者功能層0.05%,基底層1%：上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)在宮腔粘連者和正常者子宮內(nèi)膜表達(dá)均0.1%。結(jié)論：此臨床前研究結(jié)果表明MenSCs能夠培養(yǎng)擴(kuò)增獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量來滿足細(xì)胞治療的需要；在條件培養(yǎng)基和適當(dāng)?shù)拇萍に刈饔孟翸enSCs能夠在體外分化子宮內(nèi)膜細(xì)胞；聯(lián)合雌激素治療MenSCs在NOD/SCID小鼠體內(nèi)能夠重建子宮內(nèi)膜組織；宮腔鏡下診斷為宮腔粘連者M(jìn)enSCs和EnSCs均較宮腔正常者明顯減少�？傊�,運(yùn)用MenSCs治療宮腔粘連是可行的和必要的。
[Abstract]:Recent studies suggest that the occurrence of intrauterine adhesions (IUA) may be related to the decrease, deletion or dysfunction of endometrial stem cells, so stem cell transplantation is proposed to treat IUA. In addition to the advantages of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), BMSCs have the ability to proliferate faster, differentiate into three embryonic layers and express matrix metalloproteins (MMPs), which may be related to the expression of embryonic stem cell (ESCs) antigen OCT-4 and some characteristics of ESCs. The ultimate goal of this preclinical study is to restore endometrial fertility in patients with IUA. The first part is to isolate, culture and identify endometrial stem cells from menstrual blood to provide cell sources for stem cell transplantation for the treatment of intrauterine adhesions. The second part is to induce MenSCs into endometrial fineness in vitro. Cell differentiation provides a theoretical basis for stem cell therapy of intrauterine adhesions; part three: MenSCs transplanted into NOD-SCID mice renal capsule or subcutaneous, after estrogen treatment confirmed that MenSCs can reconstruct endometrial tissue in vivo; part four: investigation of hysteroscopic diagnosis of severe intrauterine adhesions of menstrual blood and endometrial tissue stem and thin Results: 1) MenSCs grew clonally in low-glucose DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, showing the growth characteristics of stem cells. Flow cytometry was used to study the effect of stem cell transplantation on the growth of IUA. The percentage of OCT-4 positive cells, CD45 0.93%+0.42%, STRO-1 1 1.80%+0.92% and HLA-DR 1.00%+0.35% in cultured blood-derived stem cells were 95.13%+0.81%, CD45 0.93%+0.42%, 1.80%+0.92% and 1.00%+0.35% respectively, indicating that the cultured cells were basically OCT-4* stem cells with low immunogenicity, and the chromosome karyotype of the cells doubled 24 times remained normal.2) Conditioned medium and estradiol 17 beta-valerate could induce endometrial cells to differentiate in vitro. The cytokeratin CK and vimentin VIM of human endometrial epithelial cells were detected by immunocytochemistry. The positive rates of CK and vimentin VIM were significantly higher after induction than before induction. The mRNA levels and protein surface of CK and VIM were also detected. The amount of MenSCs was significantly higher than that before induction (p0.05), indicating that MenSCs could be induced to differentiate into endometrial cells in vitro. 3. The cultured MenSCs were transplanted into the axillary subcutaneously of ovariectomized female NOD/SCID mice. After estrogen treatment, histopathological examination and immunohistochemical examination of CK, VIM, PR, ER and CD31 were performed. HE staining was found to be visible. Glandular structure, immunohistochemical detection of CK, VIM and PR were expressed, ER and CD31 were not expressed, confirming that MenSCs can reconstruct endometrial tissue in vivo. CD31 does not show that the blood supply of endometrial tissue in the process of reconstruction may come from the host. 4) Hysteroscopy diagnosis of intrauterine adhesions is more fertile than normal uterine cavity M. The colony formation rate of enSCs cultured in vitro was significantly lower than that of normal uterine cavity ((0.74 65507 The percentage of OCT-4 positive cells in the normal uterine cavity was significantly lower than that in the normal uterine cavity (0.1% vs 2%). The percentage of CD146 positive cells in the normal uterine cavity (0.5% vs 1%) was significantly lower than that in the normal uterine cavity (0.1% vs 2%). Basal layer 1%: EpCAM expression was 0.1% in the endometrium of both intrauterine adhesives and normal subjects. CONCLUSION: Pre-clinical studies have shown that MenSCs can be cultured and amplified to obtain enough cells to meet the needs of cell therapy; MenSCs can differentiate in vitro under conditioned medium and appropriate estrogen. Endometrial cells; MenSCs treated with estrogen can reconstruct endometrial tissue in NOD/SCID mice; MenSCs and EnSCs in hysteroscopically diagnosed intrauterine adhesions were significantly less than those in normal uterine cavity.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R711.74

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本文編號(hào)：2219756