【摘要】：卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中列居第三位,但死亡率卻占婦科腫瘤首位。由于卵巢癌位置隱匿,早期患者無臨床癥狀,70%～75%的EOC確診已是晚期。加上EOC耐化療,易轉移復發(fā),5年存活率低于30%。目前針對卵巢癌的標準治療是手術切除,輔以鉑類為主的化療,然而大部分患者在18個月內(nèi)復發(fā),并對化療藥轉為耐受型,現(xiàn)有的治療方法不能達到有效緩解的效果。傳統(tǒng)方法無力解決這些問題,迫切需要從新的視角去探索出新的治療方法。腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells,CSCs)學說認為:腫瘤是一種含有不同等級的雜合細胞群,其中包括數(shù)量極少的增殖較慢的干細胞樣的腫瘤起始細胞,快速增殖的前體細胞,及分化的腫瘤細胞組成。占極小比例的這群腫瘤細胞具有"干細胞"的特性,在發(fā)育期間能夠通過對稱性分裂以擴增數(shù)量,或者通過非對稱性分裂進行自我更新和產(chǎn)生更多不同分化類型的祖細胞和終末腫瘤細胞,在啟動腫瘤形成和生長中發(fā)揮著決定性的作用。目前大量實驗數(shù)據(jù)證明,除了造血系統(tǒng)以外,許多實體惡性腫瘤,如乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、前列腺、肺臟、肝臟和結腸等臟器來源的腫瘤組織中均檢測到腫瘤干細胞的存在,并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移、復發(fā)以及產(chǎn)生放化療抗性密切相關。許多卵巢癌研究還提示,CD33+細胞可以從卵巢癌組織或卵巢癌細胞株中分離,是一群具有腫瘤干細胞特性的細胞亞群;并證明只需少量CD133(+)細胞既可在SCID小鼠體內(nèi)成瘤;CD133是卵巢癌干細胞重要的膜表面標志物之一。那么,通過剔除卵巢癌細胞中CD133(+)細胞亞群抑制卵巢癌的復發(fā)將會是一種嶄新的有前景的治療策略。Bid分子是一個只含有BH3結構域的Bcl-2家族促凋亡分子。在凋亡發(fā)生的過程中,Bid分子N-末端附近將被以Caspase-8為主的多種蛋白酶切割產(chǎn)生tBid。通常狀況下,全長Bid分子定位于胞漿,當其被Caspase-8切割,去除N末端片段后,截短為15 kD片段的tBid從細胞漿轉位到線粒體,通過釋放細胞色素C和改變線粒體外膜通透性等機制調(diào)節(jié)細胞的凋亡。tBid是細胞凋亡通路激活的重要結點分子。因此,最先,我們計劃構建并包裝由CMV強啟動子直接調(diào)控表達高效促凋亡分子tBid的腺病毒,但是在包裝和擴增重組腺病毒的過程中,CMV啟動子強啟動的細胞毒性蛋白就已經(jīng)將包裝細胞殺死,無法得到高滴度的重組腺病毒,我們必須建立一個特異性調(diào)節(jié)tBid過度表達的系統(tǒng)Cre重組酶是一種位點特異性重組酶能介導兩個LoxP序列之間的特異性重組,使兩個同向排列的LoxP位點之間的DNA缺失反應。而這一特點正是我們所需要的,我們構建了 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒,在tBid分子編碼區(qū)的上游插入一個無關基因表達盒(Neo基因表達盒),在無關基因表達盒的兩側引入一對同向的LoxP位點,阻斷了 tBid分子的產(chǎn)生。為確保由tBid分子觸發(fā)的凋亡事件在卵巢癌干細胞中特異性發(fā)生,我們又構建了 Ad-CD133-Cre病毒。在CD133陽性的卵巢癌干細胞中,CD133啟動使Cre重組酶表達。當有Cre重組酶存在的時候,側翼含有同向LoxP位點的無關基因表達盒被去除,兩側的DNA序列自動連接起來。CMV強啟動子啟動促凋亡分子tBid大量產(chǎn)生,強效誘導CD133陽性卵巢癌細胞的快速凋亡。理論上說,細胞內(nèi)只要有很少量的Cre酶就足以切割LoxP位點序列。這樣一個由腫瘤干細胞特異性啟動子調(diào)控表達Cre重組酶的腺病毒加上一個由CMV啟動子調(diào)控表達外源分子的腺病毒構成的雙腺病毒表達系統(tǒng)建立成功,在不降低腫瘤干細胞靶向特異性的同時,能夠?qū)崿F(xiàn)高效的殺傷效果。對構建的2個病毒包裝、純化,Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 病毒滴度為 1X1010PFU/ml,Ad-CD133-Cre 病毒滴度為1 1X10 PFU/ml。從SKO-3卵巢癌細胞株中分離出CD133(+)卵巢癌細胞培養(yǎng),獲得的CD133(+)細胞培養(yǎng)后純度為99.97,而CD133(+)細胞在整個SKO-3卵巢癌細胞株中僅含0.94。20MOI的Ad-CD133-Cre與30MOIAd-cmv-Neo-tBid共同感染細胞是我們得到的一個比較適合的感染比例。為了證實構建的重組病毒Ad-CD133-Cre、Ad-cmv-Neo-tBid能有效感染CD133(+)卵巢癌細胞,我們用綠色熒光蛋白基因標記重組病毒,在熒光顯微鏡下觀察不同組別病毒感染的CD133(+)卵巢癌細胞。在對照組,細胞內(nèi)的熒光活性幾乎檢測不到;而在感染了病毒的各組CD133(+)卵巢癌細胞內(nèi)的熒光活性基本相似,明顯高于對照組,P0.001。結果提示我們構建的重組病毒能有效感染CD133(+)卵巢癌細胞。我們用qRT-PCR檢測了各組CD133(+)卵巢癌細胞中tBid的mRNA表達水平;用Western blot分析檢測了各組CD133(+)卵巢癌細胞中tBid的蛋白表達水平。對照組,感染包裝腺病毒組,感染Ad-CD133-Cre或Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒組細胞內(nèi)tBid的mRNA表達水平和蛋白表達水平基本相似。而在共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的細胞內(nèi),tBid的mRNA表達水平和蛋白表達水平較其他組四明顯升高,P0.001。結果提示:我們構建的雙腺病毒表達系統(tǒng)能有效誘導卵巢癌干細胞內(nèi)tBid的過度表達。我們又用Western blot分析檢測了 Cre和tBid在CD133-和CD133(+)卵巢癌細胞中的蛋白表達。在CD133-細胞中,Cre和tBid的蛋白表達都檢測不到。而在CD133(+)細胞中,Cre的蛋白表達僅出現(xiàn)在單獨或聯(lián)合感染了 Ad-CD133-Cre病毒的各組卵巢癌細胞中;tBid的蛋白表達僅僅出現(xiàn)在共同感染了Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的細胞中。結果提示,構建的重組雙腺病毒表達系統(tǒng)對CD133(+)卵巢癌細胞具有特異性。將感染不同病毒的各組細胞在10ng/mL人重組堿性成纖維細胞生長因子和10ng/mL人重組上皮生長因子的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。共同感染了 Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒組的細胞數(shù)量較對照組、感染包裝腺病毒組、感染Ad-CD133-Cre病毒或Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒組明顯下降。用MTT法檢測卵巢癌干細胞的生長發(fā)現(xiàn)共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的卵巢癌干細胞的細胞活性與其余組比較,明顯抑制,P0.001,而其余四組之間無明顯差別。Transwell法檢測卵巢癌干細胞的侵襲性,發(fā)現(xiàn)共同感染Ad-CD133-Cre 和 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 病毒的 CD133(+)卵巢癌細胞組下室中細胞數(shù)量明顯變少,而其余四組中細胞數(shù)量無明顯區(qū)別。將細胞數(shù)定量分析,共同感染雙病毒的CD133(+)卵巢癌細胞,細胞侵襲性明顯下降,P0.001,其它四組之間的細胞侵襲性無明顯區(qū)別。用FITC標記的Annexin V/PI雙染色法檢測CD133(+)卵巢癌細胞凋亡。發(fā)現(xiàn)Q2象限(晚期凋亡細胞或壞死細胞)中的細胞密度在共同感染了雙病毒的細胞組較其余四組明顯增多,進行定量分析后提示細胞凋亡率增高明顯,P0.001,而其余組間無明顯差別。眾所周知,體內(nèi)凋亡通路主要由內(nèi)源凋亡信號通路和外源凋亡信號通路組成。其中,由線粒體功能改變觸發(fā)的凋亡通路稱為內(nèi)源凋亡信號通路,發(fā)揮重要作用。在凋亡信號tBid的刺激下,線粒體跨膜電位降低、膜通透性增強、細胞色素C釋放,誘導Apaf-1/Caspase9凋亡誘導復合體產(chǎn)生,通過下游Caspase切割底物級聯(lián)激活凋亡事件。在此過程中,轉入線粒體的tBid對線粒體內(nèi)的重要凋亡誘導分子細胞色素C發(fā)揮至關重要的正向調(diào)控作用。我們用Western blot分析檢測了各組細胞中的細胞漿及線粒體內(nèi)細胞色素C,促凋亡蛋白Bax,caspase-3,caspase-9和抑制凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達,再用Image-Pro Plus 6.0軟件將上面的實驗結果進行量化分析,結果提示感染了我們構建的重組病毒Ad-CD133-Cre 和 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 的 CD133(+)卵巢癌細胞組與其余四組相比線粒體內(nèi)的細胞色素C水平明顯下降而胞漿內(nèi)的細胞色素C水平明顯增多;Bcl-2水平明顯下降,Bax水平明顯增多;caspase-3,caspase-9水平有所升高。所有實驗結果均有統(tǒng)計學意義,P0.005。其余四組細胞內(nèi)的相關活性物質(zhì)水平?jīng)]有明顯差異。我們還用細胞原位TUNEL法從形態(tài)學方面對CD133(+)卵巢癌細胞的凋亡進了驗證。結果與之前用FITC標記的Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡的結果相一致,在共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的細胞中,存在大量的凋亡細胞,定量分析提示差異有統(tǒng)計學意義,p0.05,而其余組中凋亡細胞的數(shù)量無明顯差異。我們檢測了構建的病毒在體外環(huán)境中是否影響CD133(+)卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。對照組、感染了 Ad-CD133-Cre 或 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 病毒組、共同感了染 Ad-CD133-Cre 和 Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid 病毒組,四組細胞加入10ug/ml順鉑處理后,用MTT檢測分析細胞數(shù)量,發(fā)現(xiàn)前三組細胞數(shù)量和空白組相比明顯減少,p0.05,但三組間無明顯差異。共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒組的細胞數(shù)量與前三組比較又有進一步下降,p0.05。FITC標記的AnnexinV/PI雙染色法檢測各組細胞凋亡,結果和之前一致,前三組中細胞凋亡的發(fā)生率有所增加,和空白組相比,p0.05,但組間差異不明顯。共同感染Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒組,細胞凋亡的發(fā)生率和前三組比較又明顯上升,p0.05。再次用細胞原位TUNEL法進行驗證,結果和我們預期的一致。結果量化分析提示前三組中凋亡細胞數(shù)和空白組相比明顯增加,p0.05。共同感染病毒組與前三組比較調(diào)亡細胞數(shù)又明顯增加,p0.05。我們在裸雌鼠右側腹部皮下注射CD133(+)卵巢癌細胞建立荷瘤裸鼠模型。每三天在瘤體內(nèi)注射不同組別的病毒,然后用游標卡尺對體內(nèi)的腫瘤體積進行觀測,腫瘤體積用公式length × width2 × π/6計算,制出裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長曲線。觀察裸鼠的存活時間,制出裸鼠存活率。發(fā)現(xiàn)對照組裸鼠全身水腫明顯,腹部膨隆,有腹水存在,腫瘤組織體積較大,邊界不清;實驗組裸鼠全身無水腫,種植的腫瘤體積較小,邊界清晰。當觀察到30天的時候,對照組裸鼠全部死亡,而實驗組還有近50%的裸鼠存活,兩組間差異明顯,P0.05。從腫瘤的生長曲線看:瘤體內(nèi)僅注射Ad-CD133-Cre或Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的裸鼠,腫瘤生長速度與空白組比較無明顯區(qū)別。而瘤體內(nèi)注射Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒的實驗組腫瘤的生長速度明顯被抑制,P0.05。我們切除裸鼠體內(nèi)的腫瘤組織,用細胞原位TUNNEL法檢測了標本的細胞凋亡數(shù)。結果顯示:對照組,瘤體內(nèi)僅注射Ad-CD133-Cre或Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒組,三組裸鼠腫瘤組織內(nèi)發(fā)生凋亡的細胞數(shù)基本相同,而瘤體內(nèi)注射Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒組,腫瘤組織內(nèi)發(fā)生凋亡的細胞數(shù)與前三組比較明顯增多,P0.05。用Wester blot法檢測各組裸鼠腫瘤組織中tBid和caspase-3的表達水平,發(fā)現(xiàn)caspase-3的表達水平與tBid的表達水平一致。前三組瘤組織中的tBid和caspase-3表達水平基本相同,而在瘤體內(nèi)注射Ad-CD133-Cre和Ad-CMV-LoxP-Neo-LoxP-tBid病毒組,腫瘤組織內(nèi)tBid和caspase-3表達水平急劇增多,P0.05。綜上所述,我們構建的腫瘤干細胞特異性雙腺病毒調(diào)控表達系統(tǒng)在體內(nèi)、體外實驗中都可以特異高效地誘導tBid過度表達,上調(diào)細胞內(nèi)的線粒體凋亡通道,產(chǎn)生大量的促凋亡活性分子,使卵巢癌腫瘤干細胞發(fā)生凋亡,能明顯延長荷瘤裸鼠的存活期。在體外實驗中,我們構建的病毒系統(tǒng)還可以增加卵巢癌腫瘤干細胞對順鉑的敏感性。我們的研究或許可以給卵巢癌的治療提供了一種嶄新的治療策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

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7 趙U，

本文編號：2173116