【摘要】：目的：通過構(gòu)建LL-37原核表達(dá)載體,優(yōu)化表達(dá)條件,純化獲得具有生物活性的LL-37重組蛋白。通過細(xì)胞及動物實驗,探討重組LL-37蛋白對外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)的療效及作用機(jī)制。 方法：1)通過基因工程構(gòu)建LL-37原核表達(dá)載體pET-Duet/LL-37。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Ecoli)M15菌株后,異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過調(diào)控誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時間優(yōu)化誘導(dǎo)條件。經(jīng)鎳離子金屬螯合(NI-IDA)親和層析純化蛋白并進(jìn)行蛋白復(fù)性,BCA法測定純化蛋白濃度。KB紙片法初步驗證純化蛋白的抗真菌活性。2)分步消化法原代培養(yǎng)人陰道上皮細(xì)胞,傳至第4代進(jìn)行實驗。將陰道上皮細(xì)胞與假絲酵母菌按1：1共培養(yǎng),構(gòu)建VVC細(xì)胞模型,分對照組和實驗組。實驗組加入純化LL-37蛋白進(jìn)后繼續(xù)培養(yǎng),對照組加入等量PBS溶液。分別于12h、24h、48h收集各組上清液。倒置顯微鏡觀察兩組不同時間段陰道上皮細(xì)胞及假絲酵母菌生長情況,采用葡萄糖消耗法比較兩組抑菌效果(以吸光度A值表示)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測兩組不同時間段IFN-γ、IL-10濃度及IFN-γ/IL-10比值的變化。3)通過定期雌激素皮下注射,構(gòu)建小鼠VVC模型。將30只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為對照組及實驗組。實驗組在成模后每天陰道灌入LL-37進(jìn)行治療連續(xù)5天,對照組以PBS溶液灌洗。5天后取小鼠陰道灌洗液及陰道壁組織,比較兩組灌洗液涂片情況及載菌量變化。ELISA檢測陰道壁組織勻漿中IL-10、IFN-γ濃度,比較兩組IFN-γ/IL-10比值的變化。 結(jié)果：1)成功構(gòu)建pET-Duet/LL-37表達(dá)載體。重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。優(yōu)化表達(dá)條件：IPTG0.5mmol/1,誘導(dǎo)時間6小時。純化得到濃度為433.92ug/ml,純度可達(dá)96%的重組蛋白。KB紙片法證實純化蛋白具有一定的抗真菌活性。2)成功構(gòu)建VVC細(xì)胞模型。隨著培養(yǎng)時間延長,對照組可見假絲酵母菌生長旺盛,吸光度呈明顯下降趨勢。實驗組陰道上皮細(xì)胞存活情況好于對照組,假絲酵母菌生長明顯受到抑制。各時間段吸光度值均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,并且下降趨勢較對照組緩慢。ELISA結(jié)果顯示,兩組IFN-γ、IL-10分泌水平均呈現(xiàn)先升后降的趨勢,于24h達(dá)高峰。各時間段比較,實驗組IFN-γ濃度于24h時明顯高于對照組(p0.05),其他時間段則無明顯差異。各時間段IL-10濃度均低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,月IFN-γ/IL-10比值均高于對照組,差異明顯。同組內(nèi)各時間段IFN-γ/IL-10比較,無明顯差異。3)成功構(gòu)建VVC小鼠模型。實驗組陰道灌洗液涂片中菌絲及孢子含量明顯低于對照組。實驗組灌洗液載菌量明顯低于對照組(p0.05)。ELISA結(jié)果顯示,實驗組IFN-γ濃度較對照組升高(p0.01),IL-10濃度降低(p0.01),IFN-γ/IL-10|比值則明顯升高(p0.05)。 結(jié)論：1)成功構(gòu)建了LL-37的原核表達(dá)載體,并純化獲得具有抗真菌活性的重組蛋白。2)細(xì)胞及動物實驗均證實,重組LL-37蛋白對VVC具有明顯的治療作用。3)重組蛋白LL-37對VVC的治療的作用機(jī)制可能為：a、抑制假絲酵母菌的粘附作用降低其致病力,并通過直接殺傷作用殺滅病原菌；b、通過影響IFN-γ、IL-10等免疫因子的分泌,調(diào)整陰道局部免疫,恢復(fù)由VVC引起的TH1/TH2失衡,從而增強(qiáng)陰道局部抗假絲酵母菌感染的能力。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R711.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2154540