發(fā)布時間：2018-07-20 09:53

【摘要】：人絨毛膜癌是惡性滋養(yǎng)葉細胞腫瘤，常發(fā)生在正常妊娠或者異常妊娠后，病變部位主要位于子宮，具有高轉(zhuǎn)移和高侵襲能力，并易通過血行轉(zhuǎn)移到全身，惡性程度極高。因此，研究絨毛膜癌的轉(zhuǎn)移機制并尋求有效的靶點抑制其轉(zhuǎn)移將有助于腫瘤的防治。目前，對腫瘤轉(zhuǎn)移能力的研究逐漸集中在蛋白翻譯后修飾，尤其是糖基化修飾，它是在各種糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下，于各功能蛋白上添加相應的糖鏈，而不同的糖殘基對蛋白功能的影響也不盡相同，從而調(diào)控各種生物學效應。本研究則主要探討了氧連接N-乙酰葡萄糖胺（O-linkedN-acetylglucosamine，O-GlcNAc）單糖修飾對絨毛膜癌細胞遷移能力的影響及其機制。 O-G1cNAc單糖修飾是普遍存在于細胞質(zhì)、核內(nèi)的一種蛋白翻譯后修飾方式，發(fā)生于蛋白結(jié)構(gòu)的絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)殘基的側(cè)鏈羥基上。它在O位-β-N-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶（OGT）的作用下僅將一個N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移到蛋白的Ser/Thr殘基上，并可以通過糖苷酶OGA移除糖鏈，在兩個酶的共同作用下保持O-G1cNAc單糖修飾的動態(tài)平衡。一些與粘附相關的功能蛋白的O糖基化修飾往往會對其自身活性和功能造成不同的影響，進而改變細胞的生物學功能，如細胞遷移、粘附、侵襲等。 本研究采用人絨毛膜癌細胞（JAR）為研究模型，首先采用OGA特異性抑制劑處理細胞，建立O-G1cNAc糖基化高表達的細胞模型，隨后進行細胞遷移實驗（transwell方法）觀察JAR細胞遷移能力是否受到影響。初步研究發(fā)現(xiàn)，O-G1cNAc蛋白糖基化修飾水平增加促進了JAR細胞的遷移，，進一步通過粘附實驗證實JAR細胞與臍靜脈血管內(nèi)皮細胞EA.hy926的粘附能力也相應增強了。說明O-G1cNAc蛋白糖基化修程度與絨毛膜癌的遷移和轉(zhuǎn)移有關。接著，通過siRNA干擾，建立了OGT基因部分沉默的細胞模型，同樣采取transwell及粘附實驗證實O-G1cNAc蛋白糖基化水平與JAR細胞遷移及粘附能力呈正相關。采用免疫共沉淀技術，發(fā)現(xiàn)OGA抑制劑處理JAR細胞后，伴隨著胞內(nèi)O-G1cNAc糖基化整體水平的增加，細胞內(nèi)重要的功能蛋白β-catenin發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾的程度也相應上升，但并未影響到β-catenin在絨毛膜癌細胞內(nèi)的蛋白表達量。此外，我們用IL-8(100ng/ml)處理絨毛膜癌細胞24小時后，通過熒光定量PCR、western blot方法檢測細胞內(nèi)的OGT及O-G1cNAc糖基化修飾程度，結(jié)果顯示OGT無論是RNA轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白翻譯水平均無明顯改變，胞內(nèi)O-G1cNAc糖基化整體水平亦無變化，說明O-GlcNAc蛋白糖基化修飾并不參與IL-8促進絨毛膜癌細胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控過程。 綜上， OGT可能通過增加β-catenin的O-GlcNAc糖基化水平促進絨毛膜癌細胞的轉(zhuǎn)移及與內(nèi)皮細胞的粘附，這可能也是絨毛膜癌高轉(zhuǎn)移性的分子機制之一。本研究為臨床上絨毛膜癌的防治提供了新的靶點及研究思路。
[Abstract]:Human choriocarcinoma is a malignant trophoblastic tumor, which usually occurs in normal pregnancy or abnormal pregnancy. The lesion is mainly located in the uterus, with high metastasis and invasiveness, and is easily metastasized to the whole body through blood, and the degree of malignancy is extremely high. Therefore, studying the metastasis mechanism of choriocarcinoma and seeking effective targets to inhibit its metastasis will be helpful to the prevention and treatment of the tumor. At present, the ability of tumor metastasis is gradually focused on protein post-translational modification, especially glycosylation modification, which is catalyzed by a variety of glycosyltransferases, and the corresponding sugar chains are added to each functional protein. The effects of different sugar residues on protein function are also different, thus regulating various biological effects. In this study, we investigated the effect of O-linkedN-acetylglucosamine-O-GlcNAc on the migration of choriocarcinoma cells and its mechanism. O-G1cNAc monosaccharide modification is a kind of post-translational modification in cytoplasm and nucleus. It occurs on the side chain hydroxyl groups of serine (Ser) and threonine (Thr) residues. It transfers only one N-acetyl glucosamine to the Ser-Thr residue of the protein under the action of O-position 尾 -N-acetyl-glucosaminotransferase (OGT), and it can remove the sugar chain through the glucosidase OGA. The dynamic equilibrium of O-G1cNAc monosaccharide was maintained under the combined action of two enzymes. The O-glycosylation modification of some functional proteins associated with adhesion may have different effects on their own activities and functions, and then change the biological functions of cells, such as cell migration, adhesion, invasion and so on. In this study, human choriocarcinoma cells (jar) were used as the study model. OGA specific inhibitors were used to treat the cells and to establish a cell model with high glycosylation of O-G1cNAc. Then the cell migration assay (transwell method) was used to observe whether the migration ability of jar cells was affected. It was found that the increase of glycosylation and modification of O-G1cNAc protein promoted the migration of jar cells, and the adhesion between jar cells and umbilical vein endothelial cells (EA.hy926) was also enhanced. These results suggest that the degree of glycosylation of O-G1cNAc protein is related to migration and metastasis of choriocarcinoma. Then, the cell model of partial silencing of OGT gene was established by siRNA interference. Transwell and adhesion experiments were used to confirm that the level of glycosylation of O-G1cNAc protein was positively correlated with the migration and adhesion ability of jar cells. By using immunoprecipitation technique, it was found that the degree of O-GlcNAc glycosylation of 尾 -catenin, an important functional protein in the cells, increased with the increase of glycosylation level of O-G1cNAc in jar cells treated with OGA inhibitor. However, the expression of 尾-catenin in choriocarcinoma cells was not affected. In addition, we treated choriocarcinoma cells with IL-8 for 24 hours and detected the degree of glycosylation of OGT and O-G1cNAc by fluorescence quantitative western blot. The overall level of glycosylation of O-G1cNAc did not change, suggesting that the glycosylation modification of O-GlcNAc protein was not involved in the regulation of IL-8 promoting the metastasis of choriocarcinoma cells. In conclusion, OGT may promote the metastasis and adhesion of choriocarcinoma cells to endothelial cells by increasing the O-GlcNAc glycosylation level of 尾 -catenin, which may also be one of the molecular mechanisms of high metastasis of choriocarcinoma. This study provides a new target for the prevention and treatment of choriocarcinoma.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

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本文編號：2133157