本文選題：子內(nèi)膜異位癥 + 內(nèi)膜數(shù)量�。� 參考：《蘇州大學》2014年博士論文

【摘要】：第一部分正常非缺血內(nèi)膜建立小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型 目的 改良“同種異體腹腔注射正常非缺血子宮內(nèi)膜”建立小鼠子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis, EM）模型，研究影響建模的因素，探討內(nèi)膜數(shù)量及注射頻次對內(nèi)膜腹腔種植的影響。 方法 以8-10周齡的雌性C57BL/6近交系小鼠為模型鼠，對 同種異體腹腔注射內(nèi)膜法‖進行如下改良：取供體鼠正常子宮內(nèi)膜均勻切成1×1mm大小，將組織塊裝入20號針頭后進行腹腔注射。研究內(nèi)容：（1）內(nèi)膜數(shù)量對內(nèi)膜腹腔種植影響：根據(jù)腹腔注射內(nèi)膜數(shù)量，建模鼠隨機分為6組（n=10）：1片組,2片組,4片組,8片組,16片組,32片組。（2）根據(jù)內(nèi)膜注射次數(shù)對內(nèi)膜種植影響：以1片內(nèi)膜作為單次注射量，注射間期為5天，根據(jù)注射次數(shù)分為5組（n=10）：1次組，2次組，3次組，4次組,5次組。建模后第7天觀察病灶，取病灶作HE染色組織學檢查。根據(jù)肉眼見典型病灶結(jié)合組織學檢查內(nèi)膜腺體為存活病灶。以成模率及內(nèi)膜存活率作為評價內(nèi)膜存活情況指標。成模率=建模成功鼠（只）/各組總建模鼠；內(nèi)膜存活率=存活內(nèi)膜總數(shù)（片）/腹腔注射內(nèi)膜總數(shù)（片）。 結(jié)果 改良后“腹腔注射內(nèi)膜法”建立EM模型具有以下優(yōu)點：改良后內(nèi)膜殘留減少，異位病灶大小均勻，病灶分散，便于觀察，成模率、內(nèi)膜存活率穩(wěn)定。（1）內(nèi)膜數(shù)量對內(nèi)膜腹腔種植影響：成模率隨著注射內(nèi)膜量增加而逐漸增加，從1片組20%（2/10）增加到8片組60%（6/10），當內(nèi)膜數(shù)量到達16片以上時成模率達到100%（10/10）; Pearson相關(guān)分析內(nèi)膜數(shù)量與成模率成正相關(guān)（R=0.982），呈二次函數(shù)曲線：Y=1.095+0.863x-0.18x2（R2=0.944，F(xiàn)=33.45，p=0.003）；內(nèi)膜種植數(shù)量與內(nèi)膜存活率相關(guān)（R=0.947），曲線擬合成二次函數(shù)曲線：Y=-1.167+3.72x-0.61x2（R2=0.972，F(xiàn)=69.127，p=0.001）�？ǚ綑z驗8片組內(nèi)膜存活率顯著高于其它各組（p0.05）。 （2）內(nèi)膜注射次數(shù)對內(nèi)膜腹腔種植的影響：隨著內(nèi)膜注射次數(shù)增加，成模率逐漸增加，由1次組20%（2/10）增至5次組100%（10/10），Pearson相關(guān)分析內(nèi)膜注射次數(shù)與成模率正相關(guān)（R=0.981），回歸分析成二次函數(shù)曲線：Y=1.095+0.863x-0.18x2（R2=0.944，F(xiàn)=33.45，p=0.003）；內(nèi)膜存活率與注射次數(shù)正相關(guān)（R=0.981），曲線擬合成冪函數(shù)曲線：Y=1.99X0.949（R2=0.962，F(xiàn)=88.357，p=0.011）。 結(jié)論改良后“同種異體腹腔注射非缺血內(nèi)膜”建立EM模型，病灶分散、病灶大小、數(shù)量、成模率、內(nèi)膜存活率變異小，模型穩(wěn)定，重復性好。內(nèi)膜數(shù)量及內(nèi)膜注射頻次是影響建模的重要因素。大量內(nèi)膜（大于16片）單次注射以及少量正常內(nèi)膜（1片）多次注射成模率高達100%，表明正常非缺血內(nèi)膜易于在腹膜種植存活。8片單次腹腔注射成模率“60%”，內(nèi)膜存活率“40%”，病灶數(shù)3-5個，適于進行各種干預(yù)試驗，是理想的EM建模方案。 第二部分缺血內(nèi)膜腹腔種植探討 目的 月經(jīng)期螺旋動脈強烈收縮導致子宮內(nèi)膜嚴重缺血達4-48h，少許缺血內(nèi)膜隨經(jīng)血逆流入盆腹腔，逆流內(nèi)膜的轉(zhuǎn)歸決定了是否發(fā)生內(nèi)異癥。但由于倫理學原因，逆流內(nèi)膜進入腹腔后的動態(tài)變化過程及轉(zhuǎn)歸目前仍不清楚。本研究以雌性C57BL/6小鼠為試驗載體，觀察不同程度缺血子宮內(nèi)膜進入腹腔后的動態(tài)變化及最終轉(zhuǎn)歸。 方法 結(jié)扎供體鼠子宮弓形血管宮體端及卵巢端的方法阻斷子宮血流，組織微氧測定儀精確測定子宮組織氧濃度已保證血管結(jié)扎可靠性。根據(jù)缺血時間（Hour）供體鼠隨機分為6組：0h組、0.5h組、1h組、2h組、4h組、8h組。根據(jù)“改良腹腔注射內(nèi)膜法”，采用8片單次注射方案進行建模。對應(yīng)于供體鼠，180只建模鼠分為6組（n=30）：0h組、0.5h組、1h組、2h組、4h組、8h組。建模后24h每組處死10只，觀察內(nèi)膜早期變化，留取標本。建模后第7天處死剩余小鼠，觀察、測量異位病灶，計算各組成模率及內(nèi)膜存活率。留取建模前供體鼠內(nèi)膜、建模后24h內(nèi)膜及異位病灶行HE染色組織學觀察，TUNEL染色測定細胞凋亡。 結(jié)果 建模前內(nèi)膜細胞凋亡指數(shù)（AI）與缺血時間正相關(guān)（R=0.865，p=0.0029;建模后缺血時間與AI呈正相關(guān)（R=0.904，p=0.0048）;建模后24h各組AI均較建模前升高（p0.05）。Spearman相關(guān)分析成模率與缺血時間呈負相關(guān)（R=-0.757，p=0.041）；內(nèi)膜存活率與缺血時間呈負相關(guān)（R=-0.986，p=0.004）。 結(jié)論 內(nèi)膜損傷程度與缺血時間正相關(guān)，嚴重缺血導致細胞壞死或凋亡。缺血內(nèi)膜進入腹腔后24h，內(nèi)膜損傷進一步加重，細胞凋亡明顯增加。缺血降低內(nèi)膜在腹腔種植存活，嚴重缺血（4h）內(nèi)膜進入腹腔后，細胞因壞死或凋亡而清除，不能在腹膜種植形成異位病灶。 第三部分缺血預(yù)處理（IPC）在缺血內(nèi)膜腹腔種植中作用及機制 目的 組織器官經(jīng)過非致死性缺血后，能夠增強其對隨后嚴重缺血耐受性即缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)。前期研究證實當內(nèi)膜缺血大于4h時，內(nèi)膜細胞進入腹腔后因凋亡而清除，不能在腹腔種植存活，這驗證了正常婦女月經(jīng)期逆流內(nèi)膜的清除機制，但EM婦女逆流內(nèi)膜能抵抗缺血誘導的細胞凋亡，在腹膜種植存活。推測：內(nèi)異癥婦女子宮異常收縮導致子宮內(nèi)膜輕度缺血，產(chǎn)生IPC作用，保護內(nèi)膜缺血性損傷，減少細胞凋亡，促進內(nèi)膜腹腔種植。本研究以C57BL/6小鼠為試驗載體建立小鼠子宮IPC模型，探討IPC在缺血內(nèi)膜腹腔種植中作用，IPC對內(nèi)膜細胞凋亡調(diào)節(jié)作用以及IPC是否通過Akt信號通路調(diào)節(jié)細胞凋亡。 方法 共分三部分內(nèi)容：（1）小鼠子宮IPC模型建立：卡前列素氨丁三醇（欣母沛）可誘導子宮收縮，導致子宮不同程度缺血。采用肌肉注射欣母沛im qd×3d的方法建立小鼠子宮IPC模型。根據(jù)欣母沛劑量，供體鼠分為5組：A組為0.125mg/kg體重， B組為0.25mg/kg體重，C組為0.5mg/kg體重，D組為1.0mg/kg體重。對照組E組肌注0.1ml注射用水。組織微氧儀動態(tài)測定子宮組織氧濃度變化，測定各組子宮最低氧濃度，缺氧（氧濃度100μ mol/l）持續(xù)時間。建模鼠對應(yīng)分為A、B、C、D、E共5組，每組20只。建模后第7天觀察病灶情況，計算各組成模率及內(nèi)膜存活率。 （2）IPC在缺血內(nèi)膜腹腔種植中作用：根據(jù)上述試驗，供體鼠以欣母沛0.5mg/kg體重，im, qd×3d作為IPC方案。第4天結(jié)扎子宮血管建立子宮內(nèi)膜缺血模型（Ischemia,ISCH）。供體鼠根據(jù)IPC及缺血時間分為6組（n=30只）：IPC組，ISCH2h（缺血2h），ISCH4h組（缺血4h），IPC+ISCH2h組， IPC+ISCH4h組，CON組（對照組）。采用改良腹腔內(nèi)膜注射法建立EM模型。受體鼠對應(yīng)分為IPC組，ISCH2h組，ISCH4h組，IPC+ISCH2h組， IPC+ISCH4h組，CON組。取建模前及建模后24h內(nèi)膜，行組織切片TUNEL染色檢測細胞凋亡變化。建模后第7天觀察病灶，計算各組建模率及內(nèi)膜存活率。 （3）IPC保護作用的分子機制本部分選擇欣母沛0.5mg/kg體重，im, qd×3d作為IPC方案，結(jié)扎子宮血管2h作為子宮內(nèi)膜ISCH模型。Akt特異性阻斷劑LY294002（LY）進行阻斷試驗，于注射欣母沛前15min，靜脈注射LY294002，劑量為10μmol/kg。根據(jù)IPC、ISCH及LY，，32只鼠隨機分為4組（n=8只）：CON組、ISCH組、IPC+ISCH組、LY+IPC+ISCH組。子宮缺血2h取內(nèi)膜組織行TUNEL染色測細胞凋亡指數(shù)，WEST檢測磷酸化Akt(p-Akt)及其下游底物磷酸化水平（p-Bad、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6），以及活化caspase-3。 結(jié)果 （1）小鼠子宮IPC模型建立：Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)最低氧濃度與欣母沛劑量呈負相關(guān)(p=0.049，R=-0.88)，缺氧持續(xù)時間與欣母沛劑量完全相關(guān)(p=0.000，R=1.0)�？ǚ綑z驗C組成模率及內(nèi)膜存活率高于A、B、D組及對照組（P0.05）。 （2）IPC在缺血內(nèi)膜腹腔種植中作用： 結(jié)果顯示IPC+ISCH2h組成模率及內(nèi)膜存活率高于ISCH2h組（p=0.028，p=0.000）；IPC+ISCH4h組成模率及內(nèi)膜存活率高于ISCH4h組（p=0.035，p=0.024）。IPC+ISCH2h組AI低于ISCH2h組（p0.05），IPC+ISCH4h組AI低于ISCH4h組（p0.05）。 （3）IPC保護作用的分子機制 結(jié)果顯示IPC+ISCH組AI低于ISCH組及IPC+ISCH+LY組（p0.05），ISCH組與IPC+ISCH+LY組AI無差別（p0.05）。IPC+ISCH組p-Akt、p-Bad、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6高于CON組及ISCH組（p0.05）；ISCH組p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6與LY+IPC+ISCH組相比無差別（p0.05）；IPC+ISCH組活化Caspase-3水平低于ISCH組及LY+IPC+ISCH（p0.05），LY+IPC+ISCH組與ISCH組無差別（p0.05）。 結(jié)論 欣母沛能有效誘導子宮收縮而缺血建立小鼠子宮IPC模型；IPC促進正常非缺血內(nèi)膜腹腔種植；IPC減少缺血內(nèi)膜細胞凋亡，促進缺血內(nèi)膜腹腔種植存活；IPC通過激活A(yù)kt信號通路，磷酸化其下游底物Bad、GSK-3β，抑制凋亡執(zhí)行分子Caspase-3活性，最終抑制缺血內(nèi)膜細胞凋亡；通過磷酸化mTOR及其下游底物4EBP1、S6，促進缺血內(nèi)膜細胞的生存。
[Abstract]:Establishment of model of endometriosis in the first part of normal non - ischemic intima

Purpose

To improve the model of endometriosis ( EM ) in mice with normal non - ischemic endometrium , the factors influencing the modeling were studied , and the influence of the number of intima and the frequency of injection on the endometrial cavity was studied .

method

浠

本文編號：2114536