本文選題：卵巢癌 + 化療抵抗��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：卵巢癌是一種高度惡性的婦科腫瘤，其5年生存率僅有20-30%，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤的首位，因其發(fā)病隱匿，又被稱為“沉默殺手”。目前卵巢癌的治療方法主要為徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療，然而卵巢癌耐藥問題的出現(xiàn)及日益加劇,直接影響卵巢癌患者的治療效果和預(yù)后，也是卵巢癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移最常見的原因。因此，探討卵巢癌耐藥發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制、如何克服和逆轉(zhuǎn)耐藥已成為卵巢癌臨床治療的研究熱點(diǎn)，以期提高治療效果，改善卵巢癌患者預(yù)后。 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransitions，EMT）是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。近來研究顯示，EMT不僅賦予癌細(xì)胞高侵襲、轉(zhuǎn)移能力，而且可賦予癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特征，促使癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的生存能力及耐藥性。因此，探索EMT獲得過程的精確機(jī)制有助于研發(fā)靶向治療藥物，與傳統(tǒng)化療藥物結(jié)合以提高惡性腫瘤治療效果。 Notch家族信號通路的活性在維持細(xì)胞增殖、凋亡及分化的過程中發(fā)揮著重要作用。在人類多種惡性腫瘤中（宮頸癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等）均有notch基因的異常表達(dá)，提示notch信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。新近研究表明，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中notch-1是調(diào)節(jié)EMT及癌干細(xì)胞表型獲得的關(guān)鍵因素，而與化療抵抗關(guān)系密切。而γ-分泌酶是激活Notch信號通路的核心環(huán)節(jié)，，故抑制其在耐藥腫瘤中的表達(dá)已成為逆轉(zhuǎn)耐藥的一種新思路。已有研究顯示,γ-分泌酶抑制劑（γ-secretaseinhibitors，GSIs）能夠抑制人類多種癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。但目前GSIs對耐藥卵巢癌的作用及其機(jī)制知之甚少。 本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3及其耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP，探討鉑耐藥的上皮性卵巢癌細(xì)胞中是否存在Notch信號通路異常激活及EMT表型的獲得，并初步研究DAPT（GSIs）能否增加卵巢癌鉑耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性及其相關(guān)分子機(jī)制，這將對改善卵巢癌患者的預(yù)后具有重要意義。 方法：將SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、青鏈霉素各l00U/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃，飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次。 1四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法 取對數(shù)生長期SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞，5000個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后,用不同濃度的DDP（0.0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml）作用于兩株細(xì)胞，使每孔終體積為200μl，培養(yǎng)48h，計(jì)算耐藥指數(shù)；用不同濃度的DAPT（25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP細(xì)胞24、48、72h，0.35%DMSO處理的SKOV3/DDP細(xì)胞做對照，測定DAPT對SKOV3/DDP細(xì)胞的生長抑制作用；按照如下實(shí)驗(yàn)分組：①對照組：（0.35%DMSO）②D DP組（2.5μg/ml）③D APT組（50μmol/L）④DDP+DAPT組（2.5μg/ml+50μmol/L），培養(yǎng)24h，測定兩藥聯(lián)合作用對SKOV3/DDP細(xì)胞增殖情況的影響，并計(jì)算金正均值。 2熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 用不同濃度的DAPT（25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP細(xì)胞48h，0.35%DMSO處理的SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞做對照，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 3real time-PCR 不同濃度的DAPT（25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP細(xì)胞，0.35%DMSO處理的SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞做對照，培養(yǎng)48h后，提取各組細(xì)胞總RNA，按照TransGen反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA,按照CWBIO real time-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增（ABI7300系統(tǒng)），檢測notch-1，E-cadherin及Vimentin mRNA的表達(dá)水平。 4流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒按步驟AnnexinV-FITC/PI雙染，檢測兩藥聯(lián)合作用對SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)分組如下：①對照組：（0.35%DMSO）②D DP組（2.5μg/ml）③D APT組（50μmol/L）④DDP+DAPT組（2.5μg/ml+50μmol/L），培養(yǎng)24h。5應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)。（P0.05）認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1MTT結(jié)果顯示，相同濃度順鉑作用48小時(shí)后，兩種細(xì)胞抑制率不同，SKOV3細(xì)胞的生長抑制率較高，除0.625μg/ml組兩種細(xì)胞生長抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P0.05），余各濃度組兩種細(xì)胞生長抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），且隨著濃度的增加，兩組細(xì)胞的抑制率差異越明顯；順鉑對SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞48h的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為2.95μg/ml和14.02μg/ml，SKOV3/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)為4.75；不同濃度的DAPT作用SKOV3/DDP細(xì)胞24h、48h和72h后，以劑量-時(shí)間依賴的方式抑制細(xì)胞生長,同一時(shí)間不同濃度組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）,不同時(shí)間相同濃度組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；DDP、DAPT組和DDP+DAPT組抑制率分別為（9.13±1.14）、（20.43±0.67）和（36.22±0.99），聯(lián)合用藥組抑制率均高于單一用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），經(jīng)金正均法計(jì)算，q值為1.311.15，表明在此濃度下，兩藥合用具有協(xié)同效應(yīng)。 2熒光顯微鏡下可見，對照組SKOV3細(xì)胞表現(xiàn)出上皮細(xì)胞樣特征，細(xì)胞之間連接緊密，呈鵝卵石樣排列，SKOV3/DDP細(xì)胞則表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞樣特征，細(xì)胞之間連接疏松，排列紊亂，呈長梭型；不同濃度的DAPT作用于SKOV3/DDP細(xì)胞48h后，細(xì)胞由長梭型逐漸變?yōu)槎趟笮停糠旨?xì)胞呈卵圓形，具備上皮細(xì)胞樣特征，75μmol/L DAPT處理組最為明顯。 3real time-PCR檢測結(jié)果顯示，DAPT處理SKOV3/DDP細(xì)胞前，notch-1及Vimentin mRNA表達(dá)水平顯著高于SKOV3細(xì)胞，E-CadherinmRNA表達(dá)水平極低，與SKOV3細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；不同濃度的DAPT作用于SKOV3/DDP細(xì)胞48h后，可使E-CadherinmRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，Vimentin mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；且以75μmol/L DAPT處理組最為明顯。 4FCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control、DDP、DAPT組和DDP+DAPT組凋亡率分別為（7.33±0.59）、（9.93±0.71）、（24.33±1.36）和（50.10±1.92），各處理組凋亡率與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），單一用藥組凋亡率均低于聯(lián)合用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論： 1DAPT能夠抑制SKOV3/DDP細(xì)胞的增殖，并呈劑量-時(shí)間依賴關(guān)系。 2SKOV3細(xì)胞在DDP誘導(dǎo)耐藥形成SKOV3/DDP細(xì)胞過程中發(fā)生notch-1信號通路異常激活，并獲得EMT樣表型，DAPT通過阻斷notch-1信號通路,誘導(dǎo)SKOV3/DDP細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（Mesenchymal-epithelial transition，MET）的形態(tài)學(xué)和分子表型改變。 3DAPT能增加SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性。
[Abstract]:Objective : Ovarian cancer is a highly malignant gynecological tumor , the 5 - year survival rate is only 20 - 30 % , the mortality rate is the first in gynecological malignant tumor .

Epithelial - mesenchymal transition ( EMT ) is a biological process in which epithelial cells are transformed into cells with interstitial phenotype through specific procedures . Recent studies have shown that EMT not only confers high invasion and metastasis ability of cancer cells , but also confers a stronger viability and resistance to cancer cells .

The activity of Notch family signaling pathway plays an important role in maintaining cell proliferation , apoptosis and differentiation . It is suggested that notch - 1 is a key factor in the development of human malignant tumors ( cervical cancer , ovarian cancer , colon cancer , pancreatic cancer , etc . ) .

In this study , we investigated whether the presence of Notch signaling pathway abnormal activation and EMT phenotype in epithelial ovarian cancer cells with platinum - resistant ovarian cancer cells were investigated by in vitro culture of ovarian cancer cell line SK3cells and its resistant cell lines . The sensitivity of platinum - resistant cells to cisplatin and its associated molecular mechanism in ovarian cancer cells were investigated .

Methods : The cells were inoculated into RPMI - 1640 medium containing 10 % fetal bovine serum and penicillin - streptomycin l00U / ml . The cells were cultured in 37 鈩

本文編號：2095609