本文選題：滋養(yǎng)細胞 + 蛋白激酶受體-1�。� 參考：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究目的1.研究PAR-1對絨毛外滋養(yǎng)細胞sFlt-1表達的影響；2.研究氧化應(yīng)激對滋養(yǎng)細胞sFlt-1表達的影響。研究方法1.PAR-1對滋養(yǎng)細胞sFlt-1表達的調(diào)控作用；1.1.人絨毛外滋養(yǎng)細胞傳代細胞株HTR-8/Svneo (H8)細胞培養(yǎng)；1.2.PAR-1干擾質(zhì)粒,過表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染H8細胞,分別設(shè)為空白對照組,抑制質(zhì)粒組,過表達質(zhì)粒組,在mRNA和蛋白水平檢測細胞PAR-1表達；1.3.實時定量PCR (qRT-PCR)檢測不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后H8細胞sFlt-1, P1GF和VEGF mRNA表達；1.4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組細胞中sFlt-1, P1GF和VEGF蛋白表達。2.氧化應(yīng)激對滋養(yǎng)細胞sFlt-1表達的調(diào)控作用2.1.使用二氯化鈷(CoCl2)及依達拉奉(eda)處理H8細胞,分別設(shè)為空白對照組,缺氧組(CoCl2).治療組(CoCl2+eda),治療對照組(eda)4組,MTT實驗檢測H8細胞活力的變化；2.2.流式細胞術(shù)檢測H8細胞內(nèi)活性氧(ROS)的變化水平；2.3. qQT-PCR分別檢測各組細胞sFlt-1, P1GF和VEGF mRNA表達；2.4. ELISA分別檢測各組細胞sFlt-1, P1GF和VEGF蛋白表達。研究結(jié)果1.PAR-1對滋養(yǎng)細胞sFlt-1表達的調(diào)控作用1.1.熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染后的H8細胞表現(xiàn)強綠色熒光信號,空白對照組無熒光信號表達,細胞轉(zhuǎn)染效率較好；1.2.同空白對照組相比,過表達質(zhì)粒組和抑制質(zhì)粒組PAR-1mRNA表達分別為：570.60±19.2(P0.05)和0.19±0.03(P0.05)；蛋白表達分別為：1.89±0.20(P0.05)和0.63+0.05(P0.05)；1.3.與空白對照組相比,過表達質(zhì)粒組,抑制質(zhì)粒組細胞sFlt-1 mRNA水平分別為：2.60±0.26(P0.05)和0.22±0.04(P0.05),蛋白分泌分別為1.49±0.13(P0.05)和0.52±.04(P0.05)：1.4.同空白對照組比較,過表達質(zhì)粒組,抑制質(zhì)粒組P1GF mRNA表達分別為：0.61+0.13(P0.05)和2.30±0.18(P0.05),蛋白表達分別為：1.06±0.03(P0.05)和1.11+0.04(P0.05)；1.5.同空白對照組比較,過表達質(zhì)粒組,抑制質(zhì)粒組VEGF mRNA表達分別為：1.44±0.24(P0.05)和2.67±0.45(P0.05)；蛋白表達分別為：0.93±0.21(P0.05)和2.08±0.05(P0.05)。2.氧化應(yīng)激對滋養(yǎng)細胞sFlt-1表達的調(diào)控作用2.1.與空白對照組比較,缺氧組細胞活性隨藥物濃度增大而逐漸下降(P0.05),最適作用濃度為500μM；治療對照組細胞活力無明顯改變(P0.05)；治療組細胞活力較缺氧組相比,隨藥物濃度增加而逐漸增加,最佳治療濃度為100μM(P0.05)；2.2.與空白組比較,缺氧組ROS明顯升高(2.41+0.27,P0.05),治療組和治療對照組較缺氧組ROS顯著降低(1.44±0.11,P0.05)；2.3.與空白組相比,缺氧組sFlt-1mRNA(2.71±0.35,P0.05)和蛋白(3.15±0.12,P0.05)表達均顯著增加,同缺氧組相比,治療組和治療對照組sFlt-lmRNA(1.22±0.12和1.12±0.17,P0.05)和蛋白(1.33±0.04和1.255±0.05,P0.05)表達均明顯降低；2.4.缺氧組,治療組,治療對照組P1GF mRNA相對表達水平分別為：2.06±0.47,3.12±0.32，，2.50±0.82(P0.05)；缺氧組同空白組比較,稍增加P1GF蛋白表達(1.32±0.10,P0.05),治療組同缺氧組相比,P1GF蛋白分泌下降(0.93±0.04,P0.05)：2.5.治療組能顯著促進H8細胞VEGF mRNA表達(5.61±1.05,P0.05),明顯高于缺氧組(2.36±0.68,P0.05)；缺氧組,治療組和治療對照組VEGF蛋白分泌分別為：0.95±0.07,0.9±0.03,1.02±0.06(P0.05)。結(jié)論1.上調(diào)PAR-1顯著促進HTR-8/SVneo細胞sFlt-1表達,下調(diào)PAR-1可抑制細胞sFlt-1產(chǎn)生,表明PAR-1通路能夠調(diào)控滋養(yǎng)細胞sFlt-1表達。2.氧化應(yīng)激促進HTR-8/SVneo細胞sFlt-1表達,氧自由基清除可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞sFlt-1的升高,表明氧化應(yīng)激對滋養(yǎng)細胞sFlt-1表達具有調(diào)控作用。研究目的1.探討PAR-1調(diào)控sFlt-1表達在胎盤血管新生和重鑄中的作用2.探討氧化應(yīng)激對sFlt-1表達的影響,在胎盤血管新生和重鑄中的作用。研究方法1.PAR-1調(diào)控sFlt-1表達在胎盤血管新生和重鑄中的作用1.1. Hoechast33258染色觀察過表達質(zhì)粒和抑制質(zhì)粒處理后H8細胞凋亡情況1.2. Western blotting檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白BAX和BCL2表達；1.3.細胞遷移實驗檢測各組細胞遷移能力的變化；1.4.細胞侵襲實驗檢測各組細胞侵襲能力的變化；1.5. qRT-PCR和ELISA實驗分別檢測各組細胞侵襲相關(guān)蛋白MMP2和TIMP2表達：1.6.管腔形成實驗檢測PAR-1調(diào)控sFlt-1表達對血管形成能力的影響1.7.共培養(yǎng)絨毛組織和蛻膜組織,觀察PAR-1調(diào)控sFlt-1表達對子宮螺旋動脈重鑄過程的影響。2.氧化應(yīng)激調(diào)控sFlt-1表達在胎盤血管新生和重鑄中的作用2.1.利用Hoechast33258染色觀察CoCl2及eda作用后H8細胞凋亡情況；2.2. Western blotting檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白BAX和BCL2表達；2.3. Transwell細胞遷移實驗檢測各組細胞遷移功能的變化；2.4. Transwell細胞侵襲實驗檢測各組細胞侵襲能力的改變；2.5. qRT-PCR和ELISA實驗分別檢測各組細胞侵襲相關(guān)蛋白MMP2和TIMP2表達；2.6.小管形成實驗檢測氧化應(yīng)激調(diào)控sFlt-1表達在血管形成中的作用；2.7.共培養(yǎng)絨毛組織和蛻膜組織,觀察氧化應(yīng)激調(diào)控sFlt-1表達對子宮螺旋動脈重鑄過程的影響。研究結(jié)果1.PAR-1調(diào)控sFlt-1表達在胎盤血管新生和重鑄中的作用1.1.同空白組相比,過表達質(zhì)粒組細胞凋亡增強(246.8+15.3%,P0.05),抑制質(zhì)粒組對細胞凋亡無明顯影響(121.4±14.8%,P0.05)；1.2.同空白對照組相比,過表達質(zhì)粒組明顯促進BAX蛋白表達(1.29±08,P0.05),抑制BCL2蛋白表達(0.79±0.05,P0.05)；抑制質(zhì)粒組明顯下調(diào)BAX蛋白表達(0.7±0.03,P0.05),上調(diào)BCL2蛋白表達(1.21±0.06,P0.05)：1.3.同空白對照組相比,過表達質(zhì)粒組顯著抑制細胞遷移功能(32.7+7.1%,P0.05),抑制質(zhì)粒組顯著促進了細胞遷移(156.9±23.4%,P0.05)。；1.4.同空白對照組相比,過表達質(zhì)粒組明顯抑制細胞侵襲(46.1±4.4%,P0.05)；抑制質(zhì)粒組顯著促進了細胞侵襲能力(121.0±7.5%,P0.05)；1.5.同空白對照組比較,過表達質(zhì)粒組抑制MMP2 mRNA(0.53±0.08,P0.05)和蛋白(0.78+0.04,P0.05)表達,促進TIMP2(1.61+0.17,1.53±0.05,P0.05表達,抑制質(zhì)粒組則顯著增加MMP2 (1.90±0.17,1.20±0.06, P0.05)表達,降低TIMP2產(chǎn)生(0.35+0.12,0.65±0.04,P0.05)；1.6.同空白對照組相比,過表達組抑制了管腔形成能力(0.38±0.04,P0.05),抑制質(zhì)粒組促進了小管形成(1.28+0.09,P0.05)：1.7.同空白對照組相比,過表達質(zhì)粒組螺旋動脈重鑄受抑制,動脈重鑄減少,抑制質(zhì)粒組動脈重鑄得到改善。2.氧化應(yīng)激調(diào)控sFlt-1表達在胎盤血管新生和重鑄中的作用2.1.較空白組相比,缺氧組相對凋亡率為336.1±21.7%,(P0.05),治療組與缺氧組相比凋亡率降低(175.0±14.4%,P0.05)；治療對照組與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(80.5±22.7%,P0.05)。2.2.同空白對照組比較,缺氧組BAX表達升高(3.47±0.74, P0.05), BCL2表達降低(0.58±0.08,P0.05)：治療組BAX蛋白表達為(0.88±0.02, P0.05), BCL2蛋白表達為(1.38±0.12,P0.05),治療對照組BAX和BCL2表達分別為(0.86±0.03和1.07+0.06,P0.05)。2.3.與空白對照組相比,缺氧組相對遷移率為30.0±5.6%,(P0.05),治療組相對遷移率明顯高于缺氧組(100.1±7.5%,P0.05),治療對照組與空白組間無差異(122.9±7.6%,P0.05)。2.4.與空白對照組相比,缺氧組相對侵襲率為12.8±3.6%,(P0.05),治療組相對侵襲率明顯高于缺氧組(68.9±4.7%,P0.05),治療對照組與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(111.5±17.3%,P0.05)。2.5.同空白對照組比較,缺氧組MMP2 mRNA(0.28±0.05, P0.05)和蛋白(0.73+0.05,P0.05)表達降低,TIMP2蛋白(1.20±04,P0.05)表達升高,治療組相比缺氧組顯著促進MMP2 (1.22±0.23,1.08±0.06, P0.05)表達,抑制TIMP2產(chǎn)生(0.12±±0.04,0.71+0.05,P0.05),治療對照組MMP2表達為(1.41±0.21,1.12±05),TIMP2表達為(0.41+0.16,0.6±0.07)；2.6.同空白對照組相比,缺氧組官腔形成能力顯著下降(0.55±0.10,P0.05),治療組促進了小管形成,顯著高于同缺氧組(0.98±0.08,P0.05),治療對照組與空白組相比無差異(0.93±0.07,P0.05)；2.7.同空白對照組相比,缺氧組螺旋動脈重鑄顯著受抑制,治療組和治療對照組動脈重鑄相對增多。結(jié)論1.上調(diào)PAR-1誘導(dǎo)HTR-8/SVneo細胞凋亡,抑制滋養(yǎng)細胞遷移、侵襲及血管形成,阻礙子宮螺旋動脈重鑄過程,下調(diào)PAR-1表達可明顯增強細胞生物學(xué)功能及管腔樣形成能力,改善螺旋動脈重鑄障礙,提示PAR-1調(diào)控sFlt-1表達在胎盤血管新生和動脈重鑄中可能具有正向調(diào)節(jié)作用；2.氧化應(yīng)激促進HTR-8/SVneo細胞凋亡,抑制細胞遷移,侵襲和管腔生成,阻礙螺旋動脈重鑄,氧自由基清除可明顯改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞生物學(xué)功能,管腔形成及動脈重鑄障礙,表明氧化應(yīng)激調(diào)控sFlt-1表達在胎盤血管新生和動脈重鑄中具有促進作用。研究目的1.通過shPAR-1胎盤局部轉(zhuǎn)染,觀察PAR-1體內(nèi)調(diào)控sFlt-1表達對胎盤血管形成的影響；2.探討體內(nèi)給予氧自由基清除劑調(diào)控sFlt-1表達在改善胎盤血管形成中的作用。研究方法1.PAR-1體內(nèi)調(diào)控sFlt-1表達改善子癇前期大鼠胎盤血管形成1.1.應(yīng)用一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)建立子癇前期孕鼠模型；1.2.將18只孕鼠隨機分為3組,治療組孕鼠胎盤局部定位注射PAR-1的shPAR-1;1.3.轉(zhuǎn)染后的胎盤行冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察熒光表達,qQT-PCR和Western blot定量檢測PAR-1表達以驗證轉(zhuǎn)染效應(yīng)；1.4.處死大鼠,收取胎盤,胎鼠,測量其大小,重量并記錄；1.5.免疫組化染色(HE和CD34)檢測轉(zhuǎn)染后胎盤組織內(nèi)微血管密度。1.6. qQT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后胎盤內(nèi)sFlt-1, P1GF和VEGF表達；1.7.ELISA測定轉(zhuǎn)染后孕鼠血清中sFlt-1, P1GF和VEGF的水平。2.氧自由基清除劑體內(nèi)調(diào)控sFlt-1表達改善子癇前期大鼠胎盤血管形成2.1.通過L-NAME建立子癇前期孕鼠模型；2.2.將20只孕鼠隨機分為4組,治療組孕鼠eda腹腔給藥；2.3.處死大鼠,收取胎盤,胎鼠,測量其大小,重量并記錄；2.4.免疫組化染色(HE和CD34)檢測轉(zhuǎn)染后孕鼠胎盤組織內(nèi)微血管密度。2.5. qQT-PCR檢測胎盤內(nèi)sFlt-1, P1GF和VEGF表達；2.6. ELISA測定孕鼠血清中sFlt-1, P1GF和VEGF的水平。研究結(jié)果1.PAR-1體內(nèi)調(diào)控sFlt-1表達改善子癇前期大鼠胎盤血管形成1.1.實驗所用18只孕鼠,麻醉低溫死亡一只,余孕鼠存活；轉(zhuǎn)染于妊娠第16天進行,轉(zhuǎn)染3天,于孕20天剖腹取胎鼠和胎盤組織；1.2.熒光顯微鏡下見胎盤組織內(nèi)強綠色熒光表達,mRNA和蛋白表達顯示治療組胎盤內(nèi)PAR-1表達明顯受抑制,證實胎盤轉(zhuǎn)染效率；1.3.孕17天前子癇前期和治療組血管均逐漸升高(P0.05),孕19天治療組血壓顯著低于子癇前期組(P0.05)；1.4.同空白對照組相比,子癇前期組胎盤內(nèi)絨毛間質(zhì)變窄,胎盤內(nèi)微血管數(shù)目減少(53.33+4.26,P0.05),治療組較子癇前期組絨毛間質(zhì)增寬,微血管密度增多(68.67+2.40,P0.05)：1.5.同空白對照組相比,子癇前期組胎盤和胎鼠大小和重量明顯降低(P0.05),胎盤肉眼觀較其他兩組稍發(fā)白,同子癇前期組比較,治療組胎盤、胎鼠得到顯著改善(P0.05)：1.6.同空白對照組比較,子癇前期組胎盤sFlt-1表達明顯增高(1.87±0.12,P0.05),治療組胎盤sFlt-1表達較子癇前期組降低(1.01±0.14,P0.05)；子癇前期組較空白對照組相比VEGF(0.44±0.05),PlGF(0.49±0.06)表達均降低(P0.05),治療組VEGF和PIGF表達增高(1.48±0.21和1.12±0.05,P0.05)。1.7.同空白對照組比較,子癇前期孕鼠血清sFlt-1表達明顯升高(2.02±0.03,P0.05),VEGF和PIGF表達(0.73±0.01,0.60±0.04,P0.05)均下降,治療組相比子癇前期組sFlt-1表達下降(0.64±0.06,P0.05),VEGF表達為(0.96±02,P0.05),PLGF蛋白水平降低(0.77±0.04,P0.05)。2.氧自由基清除劑體內(nèi)調(diào)控sFlt-1表達改善子癇前期大鼠胎盤血管形成2.1.實驗所需20只孕鼠,不明疾病死亡一只,余孕鼠存活；于妊娠16天開始,連續(xù)給藥3天,孕20天后剖腹取胎盤和胎鼠；2.2.孕15天前子癇前期和治療組血壓逐漸升高(P0.05),孕19天治療組血壓較子癇前期組明顯下降(P0.05)；2.3.同空白組相比,子癇前期組胎盤內(nèi)絨毛間質(zhì)變窄,微血管數(shù)減少(54.40±1.25,P0.05),治療組與子癇前期組相比絨毛間質(zhì)增寬,胎盤內(nèi)微血管數(shù)目相對增多(73.07±1.31,P0.05),治療對照組(76.80±3.22)與空白對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2.4.同空白對照組比較,子癇前期組胎盤和胎鼠大小和重量降低(P0.05),治療組胎盤及胎鼠較子癇前期組有所改善(P0.05),治療對照組與空白組相比無明顯差異(P0.05)；2.5.同空白對照組相比,子癇前期孕鼠胎盤中sFlt-1表達明顯增加(1.86±0.14,P0.05),VEGF(0.95±0.12,P0.05)和PIGF(0.72±0.04,P0.05)表達下降,治療組sFlt-1表達較子癇前期組明顯下降(1.12±0.12,P0.05),VEGF(1.79±0.36)和PIGF(0.96±0.01)產(chǎn)生增加(P0.05)：2.6.同空白對照組相比,子癇前期孕鼠血清中sFlt-1明顯升高(3.42±0.19,P0.05),VEGF(0.68±0.06)和PIGF(0.50±0.05)表達降低(P0.05),治療組血清中sFlt-1表達下降(1.37±0.03,P0.05),VEGF(0.84±0.03)和PIGF(0.83±0.04)表達升高(P0.05)。治療對照組各蛋白表達與空白組無明顯差異。結(jié)論1.沉默胎盤內(nèi)PAR-1基因可有效降低sFlt-1的產(chǎn)生,并增強孕鼠胎盤血管生成能力,改善子癇前期孕鼠的不良妊娠結(jié)局,表明PAR-1調(diào)控sFlt-1表達在胎盤血管形成中具有重要作用,有望成為是治療胎盤血管形成異常疾病的新的治療靶點。2.給予氧自由基清除劑可有效抑制胎盤和血清中sFlt-1的產(chǎn)生,改善孕鼠胎盤血管形成能力及不良妊娠結(jié)局,表明氧化應(yīng)激調(diào)控sFlt-1表達在改善胎盤血管發(fā)育障礙中可能具有重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714

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本文編號：2085981