發(fā)布時間：2018-06-19 15:46

  本文選題：MARCH7 + 上皮性卵巢癌��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：卵巢癌是死亡率排列于首位的婦科惡性腫瘤,其居較高的死亡率主要和卵巢癌的轉移有關。卵巢位于盆腔內,解剖位置比較深,同時發(fā)病隱匿,早期無特異性癥狀,而且缺乏行之有效的實驗室檢測手段,因此難于早期發(fā)現并診斷。大約70%的卵巢癌患者首次診斷時已經發(fā)生腹腔或者遠處轉移。卵巢癌“二元論模型”認為,卵巢癌分為高級別和低級別兩類。高級別卵巢上皮性癌占卵巢癌發(fā)病的75%,占卵巢癌病死率的90%,其發(fā)病迅速,侵襲性極強,常伴發(fā)廣泛的盆腹腔轉移和種植,預后極差。而低級別卵巢上皮性癌發(fā)病緩慢,多經歷良性、交界性和低度惡性的發(fā)展過程,多為早期,預后較好。因此高級別卵巢上皮性癌由于極易發(fā)生侵襲和轉移,是威脅婦女健康的惡性腫瘤。然而其發(fā)生侵襲和轉移的機制不明。E3泛素連接酶MARCH7是膜相關鋅指蛋白家族(RING-CH)的一員。目前研究發(fā)現MARCH7參與精子發(fā)育和微管蛋白泛素化。微管在細胞運動、腫瘤侵襲以及自噬中具有重要作用,所以我們推測MARCH7可能在腫瘤中扮演重要的角色。目前尚無MARCH7在腫瘤中的研究。因此,本課題將探索MARCH7在上皮性卵巢癌中的作用和機制,以期探討MARCH7在上皮性卵巢癌惡性生物學行為中的可能分子機制,為MARCH7在卵巢癌中的作用以及精準治療提供理論依據和基礎。第一部分MARCH7在上皮性卵巢腫瘤中的表達及其意義目的檢測在上皮性卵巢癌組織中,MARCH7蛋白表達情況,探討MARCH7的表達與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數之間的關系。方法采用免疫組織化學測定20例正常卵巢組織,138例上皮性卵巢癌組織標本中MARCH7的表達情況,分析MARCH7的表達與其臨床病理特征的相關性;q PCR檢測MARCH7 m RNA在卵巢癌細胞株(A2780,C30,COC1,COC1/DDP,ES-2,OVCA3WT,SKOV3)中的表達情況。結果(1)MARCH7在上皮性卵巢癌組織的表達明顯比正常卵巢組織增高(P0.05)。MARCH7主要定位在細胞膜和細胞質。MARCH7在漿液性卵巢癌的表達和其他上皮性卵巢癌(粘液性卵巢癌和子宮內膜樣腺癌)比較無統計學意義(P0.05)。MARCH7在晚期卵巢癌(III/IV期)表達明顯比早期卵巢(I/II期)癌高,差異有統計學意義(P0.001)。同時,MARCH7的表達和卵巢癌分級有關系,分級越高,表達越高(2-3級別和1級比較)(P0.05)。但是,MARCH7的表達和年齡無關((P0.05)。(2)MARCH7 m RNA在卵巢癌SKOV3,ES-2和OVCA3WT中表達明顯高于A2780細胞;結論MARCH7在上皮性卵巢癌組織中表達增高,同時MARCH7的表達和卵巢癌的分期、分級有關系。第二部分MARCH7對卵巢癌A2780和SKOV3細胞株惡性行為的影響目的探索沉默或者過表達MARCH7基因后對卵巢癌細胞株SKOV3和A2780細胞細胞增殖、轉移、侵襲、細胞骨架和生長等惡性生物學行為的影響。方法(1)采用CCK-8,Ed U細胞增殖實驗和克隆形成實驗檢測卵巢癌A2780和SKOV3細胞株在過表達或沉默MARCH7基因后的增殖情況;(2)采用劃痕實驗和Transwell小室檢測測卵巢癌A2780和SKOV3細胞株在過表達或沉默MARCH7基因后的轉移和侵襲能力的變化;(3)采用F-actin(鬼筆環(huán)肽)染色檢測卵巢癌A2780和SKOV3在過表達或沉默MARCH7基因后細胞骨架的改變;(4)采用裸鼠皮下移植瘤實驗觀察SKOV3細胞沉默MARCH7基因后以及A2780細胞過表達MARCH7基因后成瘤能力的變化。結果(1)SKOV3細胞沉默MARCH7基因后,細胞增殖能力降低;A2780細胞中過表達MARCH7基因后,細胞增殖能力增強。CCK-8結果顯示:卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后的第1、2、3、4和5天呈現的細胞生長曲線,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,細胞生長速度減慢(P0.05)。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體的第1、2、3、4和5天呈現的細胞生長曲線,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,細胞生長速度增快(P0.05)。Ed U細胞增殖實驗顯示:卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,Ed U細胞陽性率明顯降低(P0.05)。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,Ed U細胞陽性率明顯增加(P0.05)�？寺⌒纬蓪嶒烇@示:卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,細胞生長遲緩,形成克隆數目明顯減少(P0.05)。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,細胞生長增快,形成克隆數目明顯增多(P0.05)。(2)劃痕實驗結果顯示:卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,細胞遷移能力降低(P0.05)。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,細胞遷移能力增強(P0.05)。Transwell小室侵襲實驗結果顯示:卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,細胞侵襲能力降低(P0.05)。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,細胞遷移侵襲增強(P0.05)。(3)卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,細胞膜褶皺和板狀偽足減少。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,細胞板狀偽足和細胞膜褶皺增加。(4)卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1組和對照組LV3-NC組比較,裸鼠皮下移植瘤體積減小,重量降低(P0.001)。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,裸鼠皮下移植瘤體積增加,重量升高(P0.001)。結論卵巢癌SKOV3細胞株沉默MARCH7基因表達后,細胞增殖、轉移和侵襲能力降低;卵巢癌A2780細胞株過表達MARCH7基因后,細胞增殖、轉移和侵襲能力增強。第三部分MARCH7在上皮性卵巢癌惡性行為中的機制研究目的探究MARCH7在上皮性卵巢癌增殖以及侵襲轉移惡性行為中可能涉及的機制。方法(1)q PCR檢測TGF-β,IL-1β,TNF-α對卵巢癌SKOV3細胞株MARCH7 m RNA表達的影響;Western blot檢測TGF-β,IL-1β,TNF-α對卵巢癌SKOV3細胞株中MARCH7蛋白表達的影響;(2)雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測卵巢癌SKOV3細胞株沉默或者卵巢癌A2780細胞株過表達MARCH7基因后,NF-κB,Topflash,P53,Stata3和Notch信號通路Reporter活性的變化;(3)Western blot檢測卵巢癌SKOV3細胞株沉默或者卵巢癌A2780細胞株過表達MARCH7基因后,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin和E-Cadherin的表達情況;(4)加入NF-κB通路抑制劑PDTC或者沉默NF-κB P50和NF-κB P65后,MARCH7 m RNA和蛋白水平的變化;(5)免疫熒光檢測SKOV3細胞株沉默或者卵巢癌A2780細胞株過表達MARCH7基因后,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin的入核情況;(6)卵巢癌SKOV3細胞株沉默或者卵巢癌A2780細胞株過表達MARCH7基因后,q PCR檢測LEF1,MYC和SP5 m RNA的表達情況;(7)采用免疫組織化學檢測過表達和沉默MARCH7基因后,裸鼠移植瘤中MARCH7,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin的表達情況。結果(1)和對照組(0ng/m L)比較,10ng/m L TGF-β1刺激卵巢癌SKOV3細胞株48小時后,MARCH7 m RNA和蛋白表達水平上調,隨著TGF-β1濃度增加(20和30 ng/m L)MARCH7 m RNA和蛋白水平表達降低。和TGF-β1對MARCH7表達調控一致,IL-1β和TNF-α在10ng/m L時,對MARCH7 m RNA和蛋白表達水平上調,濃度增加(20和30 ng/m L)MARCH7 m RNA和蛋白水平表達反而降低。(2)卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,NF-κB,Topflash,Stata3和Notch信號通路Reporter活性增強,P53信號通路Reporter活性降低(P0.001)。卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,NF-κB和Topflash,信號通路Reporter活性明顯減弱(P0.05)。(3)卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin表達下調,E-Cadherin表達上調(P0.05)。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin表達上調,E-Cadherin表達下調(P0.05)。(4)加入NF-κB通路抑制劑PDTC后(10u M,30u M和50u M),卵巢癌SKOV3細胞株MARCH7 m RNA和蛋白水平表達降低,隨著濃度增加降低越明顯(P0.05)。單獨沉默NF-κB P50或NF-κB P65后,MARCH7 m RNA和蛋白水平表達降低;同時沉默NF-κB P50和NF-κB P65后,MARCH7 m RNA和蛋白水平表達進一步降低(P0.05)。(5)卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin的入核減少。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,NF-κB P65和β-catenin的入核增加。(6)卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對照組LV3-NC組比較,LEF1,MYC和SP5 m RNA的表達降低(P0.05)。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,LEF1,MYC和SP5 m RNA的表達降低增高(P0.05)。(7)免疫組化結果顯示,卵巢癌SKOV3細胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和對照組LV3-NC組比較,MARCH7,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin的表達降低(P0.05)。卵巢癌A2780細胞株感染MARCH7過表達慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對照組LV5-GFP組比較,MARCH7,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin的表達上調(P0.05)。結論MARCH7可能是通過激活NF-κB和Wnt/β-catenin信號通路來促進上皮性卵巢癌增殖、侵襲和轉移。MARCH7可能是NF-κB和Wnt/β-catenin信號通路的一個潛在的調節(jié)因子。第四部分miR-101靶向MARCH7對卵巢癌SKOV3細胞株惡性行為的影響目的研究miR-101對MARCH7的調控作用以及對卵巢癌SKOV3細胞株的惡性生物學行為的影響。方法(1)通過生物信息學預測miR-101和MARCH7 m RNA 3’UTR相互結合的位點(http://www.targetscan.org/);(2)轉染miR-101 mimics,檢測MARCH7 m RNA和蛋白水平的變化情況;(3)共轉染miR-101和MARCH7 m RNA 3’UTR結合靶點載體(p MIR-MARCH73’UTR)以及突變體(MIR-MARCH73’UTRm),雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測轉染miR-101 mimics后熒光素酶活性的變化;(4)轉染miR-101 mimics,檢測卵巢癌SKOV3細胞株增殖、轉移和侵襲能力變化;同時感染MARCH7過表達慢病毒載體后,檢測巢癌SKOV3細胞株增殖、轉移和侵襲能力變化。結果(1)生物信息學預測到miR-101和MARCH7 m RNA 3’UTR有潛在的結合位點;(2)轉染miR-101 mimics后,卵巢癌SKOV3細胞株MARCH7 m RNA和蛋白水平表達明顯降低(P0.001);(3)和對照組比較,共轉染miR-101 mimics和p MIR-MARCH73’UTR后,熒光素酶活性明顯下降(P0.05);和對照組比較,共轉染miR-101mimics和MIR-MARCH73’UTRm后,熒光素酶活性無明顯改變(P0.05);(4)轉染miR-101 mimics后,卵巢癌SKOV3細胞株增殖能力、轉移能力和侵襲能力均降低(P0.05);同時感染MARCH7過表達慢病毒載體后,卵巢癌SKOV3細胞株增殖能力、轉移能力和侵襲能力部分恢復(P0.05)。結論miR-101可以通過靶向MARCH7調控卵巢癌增殖、轉移和侵襲。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 劉健;龐亞梅;王黃震;李艷波;孫欣;徐菲;任宏;劉大鵬;;miR-101通過抑制DNA甲基轉移酶3a抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移[J];細胞與分子免疫學雜志;2016年03期

2 Huang Chuanbing;Wan Lei;Liu Jian;;Effect of Xinfeng capsule on nuclear factor kappa B/tumor necrosis factor alpha and transforming growth factor beta 1/Smads pathways in rats with cardiac injuries induced by adjuvant arthritis[J];Journal of Traditional Chinese Medicine;2016年01期

，

本文編號：2040382