本文選題：MARCH7 + 上皮性卵巢癌��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：卵巢癌是死亡率排列于首位的婦科惡性腫瘤,其居較高的死亡率主要和卵巢癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。卵巢位于盆腔內(nèi),解剖位置比較深,同時(shí)發(fā)病隱匿,早期無(wú)特異性癥狀,而且缺乏行之有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段,因此難于早期發(fā)現(xiàn)并診斷。大約70%的卵巢癌患者首次診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生腹腔或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。卵巢癌“二元論模型”認(rèn)為,卵巢癌分為高級(jí)別和低級(jí)別兩類。高級(jí)別卵巢上皮性癌占卵巢癌發(fā)病的75%,占卵巢癌病死率的90%,其發(fā)病迅速,侵襲性極強(qiáng),常伴發(fā)廣泛的盆腹腔轉(zhuǎn)移和種植,預(yù)后極差。而低級(jí)別卵巢上皮性癌發(fā)病緩慢,多經(jīng)歷良性、交界性和低度惡性的發(fā)展過(guò)程,多為早期,預(yù)后較好。因此高級(jí)別卵巢上皮性癌由于極易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移,是威脅婦女健康的惡性腫瘤。然而其發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制不明。E3泛素連接酶MARCH7是膜相關(guān)鋅指蛋白家族(RING-CH)的一員。目前研究發(fā)現(xiàn)MARCH7參與精子發(fā)育和微管蛋白泛素化。微管在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、腫瘤侵襲以及自噬中具有重要作用,所以我們推測(cè)MARCH7可能在腫瘤中扮演重要的角色。目前尚無(wú)MARCH7在腫瘤中的研究。因此,本課題將探索MARCH7在上皮性卵巢癌中的作用和機(jī)制,以期探討MARCH7在上皮性卵巢癌惡性生物學(xué)行為中的可能分子機(jī)制,為MARCH7在卵巢癌中的作用以及精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。第一部分MARCH7在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)及其意義目的檢測(cè)在上皮性卵巢癌組織中,MARCH7蛋白表達(dá)情況,探討MARCH7的表達(dá)與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)測(cè)定20例正常卵巢組織,138例上皮性卵巢癌組織標(biāo)本中MARCH7的表達(dá)情況,分析MARCH7的表達(dá)與其臨床病理特征的相關(guān)性;q PCR檢測(cè)MARCH7 m RNA在卵巢癌細(xì)胞株(A2780,C30,COC1,COC1/DDP,ES-2,OVCA3WT,SKOV3)中的表達(dá)情況。結(jié)果(1)MARCH7在上皮性卵巢癌組織的表達(dá)明顯比正常卵巢組織增高(P0.05)。MARCH7主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。MARCH7在漿液性卵巢癌的表達(dá)和其他上皮性卵巢癌(粘液性卵巢癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。MARCH7在晚期卵巢癌(III/IV期)表達(dá)明顯比早期卵巢(I/II期)癌高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。同時(shí),MARCH7的表達(dá)和卵巢癌分級(jí)有關(guān)系,分級(jí)越高,表達(dá)越高(2-3級(jí)別和1級(jí)比較)(P0.05)。但是,MARCH7的表達(dá)和年齡無(wú)關(guān)((P0.05)。(2)MARCH7 m RNA在卵巢癌SKOV3,ES-2和OVCA3WT中表達(dá)明顯高于A2780細(xì)胞;結(jié)論MARCH7在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)增高,同時(shí)MARCH7的表達(dá)和卵巢癌的分期、分級(jí)有關(guān)系。第二部分MARCH7對(duì)卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞株惡性行為的影響目的探索沉默或者過(guò)表達(dá)MARCH7基因后對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和A2780細(xì)胞細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、細(xì)胞骨架和生長(zhǎng)等惡性生物學(xué)行為的影響。方法(1)采用CCK-8,Ed U細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞株在過(guò)表達(dá)或沉默MARCH7基因后的增殖情況;(2)采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)測(cè)卵巢癌A2780和SKOV3細(xì)胞株在過(guò)表達(dá)或沉默MARCH7基因后的轉(zhuǎn)移和侵襲能力的變化;(3)采用F-actin(鬼筆環(huán)肽)染色檢測(cè)卵巢癌A2780和SKOV3在過(guò)表達(dá)或沉默MARCH7基因后細(xì)胞骨架的改變;(4)采用裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察SKOV3細(xì)胞沉默MARCH7基因后以及A2780細(xì)胞過(guò)表達(dá)MARCH7基因后成瘤能力的變化。結(jié)果(1)SKOV3細(xì)胞沉默MARCH7基因后,細(xì)胞增殖能力降低;A2780細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MARCH7基因后,細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。CCK-8結(jié)果顯示:卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后的第1、2、3、4和5天呈現(xiàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢(P0.05)。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體的第1、2、3、4和5天呈現(xiàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,細(xì)胞生長(zhǎng)速度增快(P0.05)。Ed U細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示:卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,Ed U細(xì)胞陽(yáng)性率明顯降低(P0.05)。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,Ed U細(xì)胞陽(yáng)性率明顯增加(P0.05)�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)顯示:卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩,形成克隆數(shù)目明顯減少(P0.05)。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,細(xì)胞生長(zhǎng)增快,形成克隆數(shù)目明顯增多(P0.05)。(2)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,細(xì)胞遷移能力降低(P0.05)。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(P0.05)。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,細(xì)胞侵襲能力降低(P0.05)。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,細(xì)胞遷移侵襲增強(qiáng)(P0.05)。(3)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,細(xì)胞膜褶皺和板狀偽足減少。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,細(xì)胞板狀偽足和細(xì)胞膜褶皺增加。(4)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1組和對(duì)照組LV3-NC組比較,裸鼠皮下移植瘤體積減小,重量降低(P0.001)。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,裸鼠皮下移植瘤體積增加,重量升高(P0.001)。結(jié)論卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默MARCH7基因表達(dá)后,細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力降低;卵巢癌A2780細(xì)胞株過(guò)表達(dá)MARCH7基因后,細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強(qiáng)。第三部分MARCH7在上皮性卵巢癌惡性行為中的機(jī)制研究目的探究MARCH7在上皮性卵巢癌增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移惡性行為中可能涉及的機(jī)制。方法(1)q PCR檢測(cè)TGF-β,IL-1β,TNF-α對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株MARCH7 m RNA表達(dá)的影響;Western blot檢測(cè)TGF-β,IL-1β,TNF-α對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株中MARCH7蛋白表達(dá)的影響;(2)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默或者卵巢癌A2780細(xì)胞株過(guò)表達(dá)MARCH7基因后,NF-κB,Topflash,P53,Stata3和Notch信號(hào)通路Reporter活性的變化;(3)Western blot檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默或者卵巢癌A2780細(xì)胞株過(guò)表達(dá)MARCH7基因后,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin和E-Cadherin的表達(dá)情況;(4)加入NF-κB通路抑制劑PDTC或者沉默NF-κB P50和NF-κB P65后,MARCH7 m RNA和蛋白水平的變化;(5)免疫熒光檢測(cè)SKOV3細(xì)胞株沉默或者卵巢癌A2780細(xì)胞株過(guò)表達(dá)MARCH7基因后,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin的入核情況;(6)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默或者卵巢癌A2780細(xì)胞株過(guò)表達(dá)MARCH7基因后,q PCR檢測(cè)LEF1,MYC和SP5 m RNA的表達(dá)情況;(7)采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)過(guò)表達(dá)和沉默MARCH7基因后,裸鼠移植瘤中MARCH7,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin的表達(dá)情況。結(jié)果(1)和對(duì)照組(0ng/m L)比較,10ng/m L TGF-β1刺激卵巢癌SKOV3細(xì)胞株48小時(shí)后,MARCH7 m RNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào),隨著TGF-β1濃度增加(20和30 ng/m L)MARCH7 m RNA和蛋白水平表達(dá)降低。和TGF-β1對(duì)MARCH7表達(dá)調(diào)控一致,IL-1β和TNF-α在10ng/m L時(shí),對(duì)MARCH7 m RNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào),濃度增加(20和30 ng/m L)MARCH7 m RNA和蛋白水平表達(dá)反而降低。(2)卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,NF-κB,Topflash,Stata3和Notch信號(hào)通路Reporter活性增強(qiáng),P53信號(hào)通路Reporter活性降低(P0.001)。卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,NF-κB和Topflash,信號(hào)通路Reporter活性明顯減弱(P0.05)。(3)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin表達(dá)下調(diào),E-Cadherin表達(dá)上調(diào)(P0.05)。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin表達(dá)上調(diào),E-Cadherin表達(dá)下調(diào)(P0.05)。(4)加入NF-κB通路抑制劑PDTC后(10u M,30u M和50u M),卵巢癌SKOV3細(xì)胞株MARCH7 m RNA和蛋白水平表達(dá)降低,隨著濃度增加降低越明顯(P0.05)。單獨(dú)沉默NF-κB P50或NF-κB P65后,MARCH7 m RNA和蛋白水平表達(dá)降低;同時(shí)沉默NF-κB P50和NF-κB P65后,MARCH7 m RNA和蛋白水平表達(dá)進(jìn)一步降低(P0.05)。(5)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin的入核減少。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,NF-κB P65和β-catenin的入核增加。(6)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2組與對(duì)照組LV3-NC組比較,LEF1,MYC和SP5 m RNA的表達(dá)降低(P0.05)。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,LEF1,MYC和SP5 m RNA的表達(dá)降低增高(P0.05)。(7)免疫組化結(jié)果顯示,卵巢癌SKOV3細(xì)胞株感染慢病毒攜帶的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和對(duì)照組LV3-NC組比較,MARCH7,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin的表達(dá)降低(P0.05)。卵巢癌A2780細(xì)胞株感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,LV5-MARCH7和對(duì)照組LV5-GFP組比較,MARCH7,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin的表達(dá)上調(diào)(P0.05)。結(jié)論MARCH7可能是通過(guò)激活NF-κB和Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)上皮性卵巢癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。MARCH7可能是NF-κB和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的一個(gè)潛在的調(diào)節(jié)因子。第四部分miR-101靶向MARCH7對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株惡性行為的影響目的研究miR-101對(duì)MARCH7的調(diào)控作用以及對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株的惡性生物學(xué)行為的影響。方法(1)通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-101和MARCH7 m RNA 3’UTR相互結(jié)合的位點(diǎn)(http://www.targetscan.org/);(2)轉(zhuǎn)染miR-101 mimics,檢測(cè)MARCH7 m RNA和蛋白水平的變化情況;(3)共轉(zhuǎn)染miR-101和MARCH7 m RNA 3’UTR結(jié)合靶點(diǎn)載體(p MIR-MARCH73’UTR)以及突變體(MIR-MARCH73’UTRm),雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-101 mimics后熒光素酶活性的變化;(4)轉(zhuǎn)染miR-101 mimics,檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞株增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力變化;同時(shí)感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,檢測(cè)巢癌SKOV3細(xì)胞株增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力變化。結(jié)果(1)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到miR-101和MARCH7 m RNA 3’UTR有潛在的結(jié)合位點(diǎn);(2)轉(zhuǎn)染miR-101 mimics后,卵巢癌SKOV3細(xì)胞株MARCH7 m RNA和蛋白水平表達(dá)明顯降低(P0.001);(3)和對(duì)照組比較,共轉(zhuǎn)染miR-101 mimics和p MIR-MARCH73’UTR后,熒光素酶活性明顯下降(P0.05);和對(duì)照組比較,共轉(zhuǎn)染miR-101mimics和MIR-MARCH73’UTRm后,熒光素酶活性無(wú)明顯改變(P0.05);(4)轉(zhuǎn)染miR-101 mimics后,卵巢癌SKOV3細(xì)胞株增殖能力、轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力均降低(P0.05);同時(shí)感染MARCH7過(guò)表達(dá)慢病毒載體后,卵巢癌SKOV3細(xì)胞株增殖能力、轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力部分恢復(fù)(P0.05)。結(jié)論miR-101可以通過(guò)靶向MARCH7調(diào)控卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉健;龐亞梅;王黃震;李艷波;孫欣;徐菲;任宏;劉大鵬;;miR-101通過(guò)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2016年03期

2 Huang Chuanbing;Wan Lei;Liu Jian;;Effect of Xinfeng capsule on nuclear factor kappa B/tumor necrosis factor alpha and transforming growth factor beta 1/Smads pathways in rats with cardiac injuries induced by adjuvant arthritis[J];Journal of Traditional Chinese Medicine;2016年01期

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本文編號(hào)：2040382