本文選題：EOC + c-Abl　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：女性生殖器官最常見三大惡性腫瘤包括子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢惡性腫瘤，發(fā)病率均呈逐年上升趨勢。卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率位居前兩位之后，但其死亡率卻高居第一。由病理學(xué)檢查確診，卵巢惡性腫瘤中約有85%～90%為卵巢惡性上皮性腫瘤。上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer, EOC）死亡率高主要原因有以下幾點(diǎn)：1）卵巢隱匿于盆腔深部，檢查時不易及時發(fā)現(xiàn)病變卵巢；2）絕大多數(shù)EOC患者早期無明顯癥狀和體征，不易發(fā)現(xiàn)，確診時有75%以上的患者疾病已經(jīng)進(jìn)展到腫瘤中晚期（FIGO III～I(xiàn)V期）；3）EOC在腫瘤早期時就具有盆腹腔播散轉(zhuǎn)移的特性，且術(shù)后極易復(fù)發(fā)；4）EOC患者對于鉑類、紫杉醇等一線化療藥物易產(chǎn)生耐藥。近幾年，臨床上即使采取了腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)加聯(lián)合藥物化療等綜合治療手段，同時改進(jìn)了術(shù)中方法和增加新的靶向治療方案，但對于EOC患者來說，并未有效地改善其預(yù)后。根據(jù)文獻(xiàn)資料表明，EOC患者的5年生存率始終徘徊在30%左右。據(jù)報道，世界上每年有近204,000名的新發(fā)病例，約125,000名女性不幸死于卵巢癌，對廣大婦女的家庭生活和健康造成嚴(yán)重威脅。目前，對于EOC的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致卵巢癌治療失敗和患者死亡的主要原因，因此探討卵巢癌的惡性生物學(xué)行為及其發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)一直是婦科腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。 惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一種復(fù)雜的惡性生物學(xué)行為，癌細(xì)胞先在原發(fā)病變區(qū)域增殖，繼而向周圍鄰近組織浸潤并使其發(fā)生破壞，然后脫離原發(fā)病灶，經(jīng)血道及淋巴道轉(zhuǎn)移，在遠(yuǎn)處器官形成單個或多個轉(zhuǎn)移瘤。在這一系列過程中，關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于癌細(xì)胞向周圍正常組織的浸潤侵襲，而啟動這一步驟依賴于癌細(xì)胞的極化運(yùn)動能力。癌細(xì)胞的侵襲過程，主要是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白的聚合及解聚提供的動力，使癌細(xì)胞偽足得到支持能夠維持延伸而發(fā)生遷移。致力于探究肌動蛋白如何在腫瘤細(xì)胞侵襲偽足部位聚合，如何調(diào)節(jié)各肌動蛋白之間的協(xié)作，也許可以達(dá)到控制癌細(xì)胞侵襲的目的。本課題組前期在“吸煙與粘液性卵巢癌的發(fā)病相關(guān)性”以及“上皮性卵巢癌早期診斷研究”中采用反向捕獲抗體芯片，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清中均存在WAVE1（Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein1, WAVE1）蛋白升高，具有血清差異性表達(dá)意義，提示其可能是EOC的一個標(biāo)志蛋白。通過課題組成員前期研究發(fā)現(xiàn)，WAVE1作為一種新型肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白，在EOC的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性行為中發(fā)揮著重要的作用，同時研究發(fā)現(xiàn)ABL酪氨酸激酶參與WAVE1介導(dǎo)的肌動蛋白骨架重排過程。c-Abl酪氨酸激酶屬于非受體Abelson酪氨酸激酶超家族中的一員，由于在其羧基端具有F-actin、G-actin結(jié)構(gòu)域。在一定的條件下，c-Abl激酶可以直接同纖維性和球形肌動蛋白相結(jié)合，在細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞偽足（如絲狀偽足、侵襲性偽足）聚集形成過程中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、慢性髓性白血病、惡性黑色素瘤、胃腸道間質(zhì)惡性腫瘤等腫瘤中，c-Abl均呈高表達(dá)，提示c-Abl可能在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色。伊馬替尼（imatinib/STI571）是一類非受體酪氨酸激酶特異性小分子抑制劑，具有c-Abl、c-kit及PDGFR等多個有效靶點(diǎn)。最早用于慢性髓性白血病的治療，并獲得了令人滿意的臨床效果。在前列腺癌、大腸癌、胃癌等惡性實(shí)體腫瘤中伊馬替尼的治療作用也得到肯定。近年來，國外有學(xué)者進(jìn)行關(guān)于伊馬替尼類酪氨酸激酶抑制劑在治療復(fù)發(fā)性卵巢癌、難治性卵巢癌及對鉑類和紫杉醇耐藥的卵巢癌治療效果的臨床藥理實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，對于存在酪氨酸激酶表達(dá)的卵巢癌患者，伊馬替尼也許能獲得一定的臨床受益。但目前對于c-Abl在EOC中的相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。因此，本課題將從以下四個部分對c-Abl在EOC發(fā)生發(fā)展及侵襲行為中的作用進(jìn)行研究，以期探討c-Abl在EOC惡性生物學(xué)行為中可能涉及的分子機(jī)制，為非受體酪氨酸激酶抑制劑治療卵巢癌的臨床可行性補(bǔ)充理論依據(jù)。 第一部分c-Abl在上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義 目的 檢測在不同EOC標(biāo)本中c-Abl蛋白表達(dá)情況，探討c-Abl的表達(dá)與EOC患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性。 方法 （1）采用免疫組織化學(xué)測定22例正常卵巢組織，28例良性卵巢腫瘤組織，18例交界性卵巢腫瘤組織及137例EOC組織標(biāo)本中c-Abl的表達(dá)情況，分析c-Abl的異常表達(dá)與其臨床病理特征的相關(guān)性。 （2）采用Western blot測定18例正常卵巢組織標(biāo)本，17例卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本，14例卵巢交界性腫瘤組織標(biāo)本和32例EOC組織標(biāo)本中c-Abl的表達(dá)情況，分析c-Abl的異常表達(dá)與其臨床病理特征的相關(guān)性。 （3）應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析比較不同EOC組織標(biāo)本中c-Abl表達(dá)強(qiáng)弱對患者生存時間的影響；Cox回歸分析研究關(guān)于EOC患者生存時間的相關(guān)影響因素。 （4）采用Western blot檢測不同人卵巢癌細(xì)胞株（SKOV3、3AO、OVCAR-3、ES-2）中c-Abl蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)探究c-Abl在人卵巢癌細(xì)胞株中的亞細(xì)胞定位。 結(jié)果 （1）免疫組化結(jié)果顯示，在137例EOC組織標(biāo)本中，c-Abl呈強(qiáng)陽性表達(dá)有94例（68.6%），低表達(dá)或不表達(dá)者有43例（31.4%）；在正常卵巢組織21例（95.5%）、卵巢良性腫瘤24例（85.7%）及卵巢交界性腫瘤14例（77.8%）呈c-Abl不表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計意義（P＜0.05）。在EOC中，F(xiàn)IGO分期中III～I(xiàn)V期的c-Abl蛋白表達(dá)水平顯著高于I～I(xiàn)I期組織（P＜0.001），c-Abl表達(dá)水平在病理分化程度為中低分化顯著高于高分化者（P＜0.001），c-Abl表達(dá)水平在EOC患者血漿Ca-125≥35U/ml的顯著高于Ca-125＜35U/ml（P=0.019），c-Abl表達(dá)在術(shù)后殘余腫瘤直徑≥1cm的EOC患者顯著高于術(shù)后殘余腫瘤直徑＜1cm者（P=0.015），但與EOC患者腹水情況、病灶單雙側(cè)、年齡、腫瘤大小及病理學(xué)類型無關(guān)（P＞0.05）。 （2）Western blot結(jié)果顯示，EOC組織標(biāo)本中c-Abl的表達(dá)顯著高于正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢交界性腫瘤組織(分別為：1.704±0.382，0.317±0.062，0.334±0.066，0.346±0.068)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在EOC組織中，c-Abl蛋白表達(dá)水平與EOC組織分化程度、術(shù)后殘余腫瘤直徑大小、患者血漿Ca-125水平、FIGO腫瘤分期有關(guān)（P＜0.05），而與EOC患者腹水情況、病灶單雙側(cè)、年齡、腫瘤大小及病理學(xué)類型無關(guān)（P＞0.05）。 （3）Kaplan-Meier生存分析顯示，c-Abl高表達(dá)的EOC患者生存時間顯著短于c-Abl低表達(dá)的患者（P＜0.05），多變量分析表明不滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)、c-Abl高表達(dá)和FIGO分期中晚期可能是EOC預(yù)后的獨(dú)立因素。 （4）c-Abl在SKOV3、3AO、 ES-2、OVCAR-3中的表達(dá)分別為：1.044±0.138，0.905±0.096，0.943±0.170，0.855±0.750；通過激光共聚焦顯微鏡觀察到c-Abl與肌動蛋白共表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上。 結(jié)論 （1）c-Abl在不同EOC細(xì)胞和組織標(biāo)本中呈高表達(dá)。高表達(dá)的c-Abl與EOC腫瘤分化、術(shù)后殘余腫瘤直徑大小、腫瘤分期及患者血漿Ca-125水平有關(guān)。 （2）c-Abl的高表達(dá)與EOC侵襲及患者不良預(yù)后相關(guān)，提示c-Abl可能在EOC惡性行為中扮演著重要的角色。 第二部分c-Abl基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞株的篩選 目的 采用RNAi（RNA interference，RNAi）技術(shù)設(shè)計、構(gòu)建c-Abl的shRNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒包裝載體，鑒定、篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人卵巢癌細(xì)胞株（SKOV3），以便為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。 方法 （1）設(shè)計并化學(xué)合成四條含高效特異性靶向c-Abl基因的重組質(zhì)粒和一條陰性對照。主要通過雙酶切實(shí)驗(yàn)以及精確的測定DNA序列對其重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。 （2）將經(jīng)序列測定驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝，將pMagic7.1轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞經(jīng)收集、提純、最后測定病毒滴度。采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染法，將包裝好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SKOV3中，不斷培養(yǎng)并逐步建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。 （3）采用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組細(xì)胞中c-Abl蛋白表達(dá)的變化；采用Real-time PCR測定上述三組細(xì)胞中mRNA表達(dá)量的變化，驗(yàn)證并獲得c-Abl基因抑制效果最佳的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。 結(jié)果 （1）設(shè)計合成四條c-Abl特異性shRNA，經(jīng)雙酶切法及DNA序列測定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了c-Abl基因RNAi的慢病毒載體。 （2）慢病毒載體介導(dǎo)的c-Abl-shRNA1、 c-Abl-shRNA2、c-Abl-shRNA3、 c-Abl-shRNA4和陰性對照成功轉(zhuǎn)入SKOV3，采用嘌呤霉素進(jìn)行篩選并獲得穩(wěn)定表達(dá)的SKOV3單克隆細(xì)胞株。 （3）采用Western blot和Real-time PCR檢測和驗(yàn)證，獲得c-Abl基因抑制效果最顯著的SKOV3-Ri2細(xì)胞。 結(jié)論 成功構(gòu)建了c-Abl基因的特異性重組質(zhì)粒。利用慢病毒載體進(jìn)行包裝，成功篩選獲得c-Abl基因抑制效果最佳的SKOV3，為進(jìn)一步研究c-Abl在EOC中惡性生物學(xué)行為及其可能相關(guān)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 第三部分慢病毒介導(dǎo)的c-Abl基因沉默對SKOV3細(xì)胞株惡性行為的影響 目的 探究干擾c-Abl基因后對卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞增殖、粘附、生長及侵襲等惡性生物學(xué)行為的影響。 方法 （1）采用Transwell小室檢測SKOV3細(xì)胞在c-Abl基因沉默前后其遷移和侵襲能力的改變。 （2）采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)研究SKOV3細(xì)胞在c-Abl基因沉默前后其粘附能力的改變。 （3）采用MTT法測定SKOV3細(xì)胞在c-Abl基因沉默前后其增殖能力的改變。 （4）采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察SKOV3細(xì)胞在c-Abl基因沉默前后其細(xì)胞群體增殖能力、依賴性的改變。 （5）采用裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察SKOV3細(xì)胞在c-Abl基因沉默前后其成瘤能力的改變。 結(jié)果 （1）干擾c-Abl表達(dá)使EOC細(xì)胞侵襲能力受到明顯抑制： Transwell小室遷移結(jié)果顯示，干擾組SKOV3-Ri2穿過聚碳酸脂膜遷移細(xì)胞個數(shù)較正常對照組、陰性對照組均明顯減少（P＜0.05）。 Transwell小室侵襲結(jié)果顯示，干擾組SKOV3-Ri2穿過Matrigel侵襲細(xì)胞個數(shù)較正常對照組、陰性對照組均明顯減少（P＜0.05）。 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示，干擾組SKOV3-Ri2的細(xì)胞間粘附能力較正常對照組、陰性對照組均顯著下降（P＜0.05）。 （2）干擾c-Abl表達(dá)使EOC細(xì)胞生長增殖能力受到明顯抑制： MTT結(jié)果顯示，SKOV3-Ri2組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后1d、2d、3d、4d以及5d，呈現(xiàn)的細(xì)胞生長曲線較正常對照組、陰性對照組平緩，生長速度亦呈現(xiàn)減緩（P＜0.05）。 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，SKOV3-Ri2干擾組細(xì)胞生長速度較正常對照組、陰性對照組遲緩，形成克隆數(shù)目明顯減少（P＜0.05）。 （3）干擾c-Abl表達(dá)使裸鼠皮下成瘤能力受到明顯抑制： 干擾組SKOV3-Ri2形成的移植瘤較陰性對照組瘤體體積小，成瘤能力明顯減弱，生長速度緩慢。 結(jié)論 細(xì)胞株SKOV3增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力在c-Abl基因沉默后受到明顯抑制，提示c-Abl可能在EOC的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中扮演著重要角色，進(jìn)一步為臨床上應(yīng)用c-Abl抑制劑治療EOC提供有力的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持。 第四部分c-Abl在上皮性卵巢癌惡性行為中的分子機(jī)制研究 目的 探究c-Abl在上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移及增殖惡性行為中可能涉及的分子機(jī)制。 方法 （1）采用HE染色觀察不同裸鼠移植瘤中腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 （2）采用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測陰性對照組和干擾組裸鼠移植瘤中與侵襲轉(zhuǎn)移、增殖相關(guān)蛋白E-cadherin、MMP-2、MMP-9、VEGF、cyclin D1的水平變化。 （3）采用Western blot檢測SKOV3細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2；AKT、p-AKT；P38MAPK、p-P38MAPK蛋白水平的變化在c-Abl基因沉默前后。 結(jié)果 （1）HE染色結(jié)果顯示，SKOV3-Ri2移植瘤腫瘤細(xì)胞排列較整齊，可見極性，而SKOV3-NC移植瘤腫瘤細(xì)胞失去極性，排列紊亂。 （2）免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，在SKOV3-Ri2組中MMP-2、cyclin D1、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平較SKOV3-NC組顯著降低，，但E-cadherin蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)上升（P＜0.05）。 （3）Western blot檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白水平結(jié)果顯示，相對于SKOV3-NC細(xì)胞，SKOV3-Ri2細(xì)胞中AKT、p-AKT和p-P38MAPK蛋白明顯降低（P＜0.05）。而P38MAPK、ERK1/2及p-ERK1/2無明顯變化（P＞0.05）。 結(jié)論 在EOC細(xì)胞中，上調(diào)的c-Abl可能通過介導(dǎo)PI3K/AKT、P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活其下游相關(guān)效應(yīng)蛋白參與EOC的惡性行為。c-Abl可能是PI3K/AKT和P38MAPK信號通路中潛在的調(diào)節(jié)因子。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2008931