本文選題：卵巢癌細(xì)胞 + IL-17D��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：以基因轉(zhuǎn)染的方法建立能穩(wěn)定表達(dá)和分泌IL-17D的人上皮性卵巢癌細(xì)胞株，通過(guò)檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染前后卵巢癌細(xì)胞中IL-17D的表達(dá)差異以及外源性IL-17D轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞表面NKG2D配體MICA的影響，探討IL-17D對(duì)人卵巢癌細(xì)胞及固有免疫的體外影響。 方法： 1體外培養(yǎng)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞SKOV3、空載體對(duì)照細(xì)胞SKOV3/vector、外源性人IL-17D基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞SKOV3/IL-17D及順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP；以及人卵巢腺癌細(xì)胞OVCAR3、空載體對(duì)照細(xì)胞OVCAR3/vector、IL-17D基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞OVCAR3/IL-17D，連續(xù)傳代培養(yǎng)，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 2MTT法檢測(cè)不同濃度的順鉑對(duì)SKOV3及SKOV3/CDDP的抑制率，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50及耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP的耐藥指數(shù)。 3MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)（12、24、48、72、96h）7種上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖情況，繪制生長(zhǎng)曲線。 4提取7種上皮性卵巢癌細(xì)胞的RNA，利用real-time PCR在RNA水平檢測(cè)7種卵巢癌細(xì)胞IL-17D的表達(dá)情況。 5應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)NKG2D主要活化性配體MICA在7種上皮性卵巢癌細(xì)胞表面的表達(dá)水平，以熒光指數(shù)（FI）表示MICA蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。FI=試驗(yàn)品均道值/對(duì)照品均道值，均道值=lg(x-mode值)×340。 結(jié)果： 1人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3/CDDP耐藥指數(shù)=SKOV3/CDDP的IC50值/SKOV3的IC50值，即36.09/7.83=4.61，可進(jìn)行耐藥試驗(yàn)。 2人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞、人卵巢腺癌OVCAR3細(xì)胞分別組內(nèi)兩兩比較，轉(zhuǎn)染組生長(zhǎng)速度明顯快于未轉(zhuǎn)染組與空載體組（P0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；未轉(zhuǎn)染組與空載體組間無(wú)明顯差異（P0.05）；耐藥組SKOV3/CDDP細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯快于親本未轉(zhuǎn)染組（P0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；耐藥組SKOV3/CDDP與轉(zhuǎn)染組SKOV3/IL-17D比較無(wú)明顯差異（P0.05）。 3qRT-PCR分別檢測(cè)SKOV3、SKOV3/CDDP、SKOV3/vector、SKOV3/IL-17D及OVCAR3、OVCAR3/vector、OVCAR3/IL-17D七種細(xì)胞內(nèi)IL-17D的表達(dá)。以2-ΔΔCт表示IL-17D的相對(duì)表達(dá)量。 以SKOV3細(xì)胞內(nèi)IL-17D的表達(dá)為對(duì)照組，我們通過(guò)qRT-PCR可以檢測(cè)出SKOV3/vector、SKOV3/IL-17D、SKOV3/CDDP細(xì)胞內(nèi)IL-17D表達(dá)量分別為1.13±0.24、113.11±24.45、91.96±18.13，經(jīng)單因素方差分析示組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.40，P=0.0000.05）；組內(nèi)比較：SKOV3與SKOV3/vector、SKOV3/IL-17D與SKOV3/CDDP比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 以O(shè)VCAR3細(xì)胞內(nèi)IL-17D的表達(dá)為對(duì)照組，我們通過(guò)qRT-PCR可以檢測(cè)出OVCAR3/vector、OVCAR3/IL-17D細(xì)胞IL-17D表達(dá)量分別為1.10±0.07、182.78±16.37，經(jīng)單因素方差分析示組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=369.89，P=0.0000.05）；組內(nèi)比較：OVCAR3與OVCAR3/vector比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)果顯示：SKOV3/IL-17D及OVCAR3/IL-17D內(nèi)IL-17D的含量均高于其未轉(zhuǎn)染組和空載體對(duì)照組；耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP內(nèi)IL-17D的含量明顯高于其親本細(xì)胞SKOV3。 4FCM檢測(cè)7種上皮性卵巢癌細(xì)胞表面MICA的表達(dá)。 SKOV3細(xì)胞組：經(jīng)單因素方差分析顯示組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=598.61，，P=0.000.05），組內(nèi)多重比較，SKOV3與SKOV3/vector、SKOV3/IL-17D與SKOV3/CDDP比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 OVCAR3組：組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1032.37，P=0.000.05），組內(nèi)比較：OVCAR3與OVCAR3/vector比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)果顯示：IL-17D轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表面MICA的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前降低；SKOV3/CDDP耐藥株細(xì)胞表面MICA表達(dá)量低于親本細(xì)胞株。 結(jié)論： 1我們可以在體外獲得IL-17D特異性表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞株。 2人卵巢漿液性乳頭狀腺癌的耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP內(nèi)IL-17D的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其親本細(xì)胞SKOV3，推測(cè)IL-17D可能與細(xì)胞耐藥性有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。 3轉(zhuǎn)染IL-17D后的細(xì)胞增殖速度明顯加快，推測(cè)IL-17D可能具有促進(jìn)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用；且IL-17D表達(dá)量較高的細(xì)胞都伴隨著其表面MICA表達(dá)的下降，細(xì)胞表面MICA的下調(diào)可導(dǎo)致NK細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用減弱，從而為今后探討卵巢癌的靶向治療及免疫逃逸提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Objective: to establish a human epithelial ovarian cancer cell line that can express and secrete IL-17D by gene transfection. By detecting the difference of IL-17D expression in ovarian cancer cells before and after gene transfection and the effect of exogenous IL-17D transfection on the NKG2D ligand MICA on the surface of ovarian cancer cells, IL-17D has been explored for human ovarian cancer cells and inherent immunity. In vitro influence.
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本文編號(hào)：2004998