本文選題：功能失調(diào)性子宮出血 + 基質(zhì)金屬蛋白酶2和9　； 參考：《南華大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：功能失調(diào)性子宮出血(Dysfunctional Uterine Bleeding,DUB)簡稱功血,是由于下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂所致的異常子宮出血,分為無排卵性功血(anovulatory dysfunctional uterine bleeding,ADUB)和排卵性功血(ovulatory dysfunctional uterine bleeding,ODUB)兩類,是婦科常見病,嚴(yán)重危害婦女身心健康。有研究表明多數(shù)DUB中雌激素和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2/9)水平增高,且雌激素可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),認(rèn)為雌激素刺激是DUB的誘因,但是,雌激素引起DUB的分子機(jī)制尚不清楚,也不明確MMPs、VEGF在其機(jī)制中的具體作用。為研究雌激素是否能直接刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞MMP-2/9表達(dá),推測DUB的發(fā)生機(jī)制,在海南省自然科學(xué)基金(30633\812148)的資助下,研究發(fā)現(xiàn)ADUB的子宮內(nèi)膜MMP-2/9表達(dá)增高,雌激素能誘導(dǎo)原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞MMP-2/9增高表達(dá),通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)后激活ErK信號通路來調(diào)節(jié)MMP-2/9表達(dá)水平,VEGF起中心調(diào)節(jié)作用;在此基礎(chǔ)上,分別從動物細(xì)胞和整體水平研究雌激素刺激后MMP-2/9和緊密連接蛋白Occludin、Claudin-5、ZO-1的表達(dá),檢測子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮單層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜血管的通透性,確定雌激素刺激后增加MMP-2/9的表達(dá),并且MMP-2/9的增高表達(dá)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜血管通透性增加,而MMP-2/9抑制劑SB-3CT能降低子宮內(nèi)膜血管通透性,為治療無排卵性功血的新藥研發(fā)提供科學(xué)的理論依據(jù);同時研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)SELDI技術(shù)篩選鑒定出ADUB和ODUB共同的血清標(biāo)志物血清淀粉樣蛋白A(SAA),發(fā)現(xiàn)高濃度SAA降低子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(ESC)活力,在一定的濃度范圍內(nèi),SAA劑量和時間依賴性下調(diào)VEGF表達(dá),揭示SAA在DUB的診治和預(yù)后中的臨床意義。第一部分vegf在雌激素誘導(dǎo)mmp-2/9表達(dá)中作用目的:研究雌激素誘導(dǎo)功血的分子機(jī)制。已知vegf與長期無孕酮對抗的雌激素刺激導(dǎo)致的功血發(fā)生相關(guān)聯(lián),mmps通過分解膠原增加血管通透性,但雌激素如何誘導(dǎo)vegf表達(dá)以及vegf如何調(diào)控mmps的表達(dá)尚不清楚。故這一部分的研究擬在adub的子宮內(nèi)膜上及原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上研究vegf調(diào)控mmps表達(dá)的信號途徑,分析并找出其分子機(jī)制。方法:原位zymography技術(shù)檢測adub患者子宮內(nèi)膜中mmp2/9的活性和表達(dá)水平,原代培養(yǎng)的人子宮上皮細(xì)胞,用雌激素刺激細(xì)胞,實(shí)時rt-pcr和westernblot分別檢測mrna和蛋白表達(dá)水平,明膠zymography檢測mmp-2/9的活性,觀測vegf沉默后細(xì)胞p44/42mapk通路變化,及mmp-2/9表達(dá)水平變化,及p44/42mapk特異阻斷劑u0126阻斷erk的磷酸化對mmp-2/9及vegf表達(dá)的影響。結(jié)果:adub患者子宮內(nèi)膜中mmp2/9的活性和表達(dá)水平都增高,原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)雌激素能誘導(dǎo)mmp-2/9和vegf表達(dá)增高,同時,發(fā)現(xiàn)雌激素能激活p44/42mapk(erk1/2)信號通路,rna干擾技術(shù)沉默vegf的表達(dá)后細(xì)胞p44/42mapk通路被阻斷,且mmp-2/9表達(dá)下調(diào),u0126阻斷erk的磷酸化能下調(diào)mmp-2/9的表達(dá)但不能下調(diào)vegf的表達(dá)。結(jié)論:vegf首先激活erk1/2信號通路,然后通過erk1/2的磷酸化刺激mmp-2/9表達(dá),vegf在雌激素誘導(dǎo)mmp-2/9的表達(dá)中起中心調(diào)節(jié)作用。第二部分雌激素對大鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性影響及分子機(jī)制目的:研究雌激素對大鼠子宮內(nèi)膜組織血管通透性和原代培養(yǎng)的大鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響,及其通透性改變與mmp2/9表達(dá)水平、細(xì)胞緊密連接蛋白、vegf表達(dá)水平的關(guān)系。方法:transwell裝置測定單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,qrt-pcr和western-blotting分別檢測mmp2/9及細(xì)胞緊密連接蛋白(occludin、claudin-5、zo-1)的mrna和蛋白表達(dá)水平,明膠酶譜法測定mmp2/9活性,mtt法分析細(xì)胞活力,冰凍切片后pi染色測定大鼠子宮內(nèi)膜組織血管通透性,細(xì)胞免疫熒光測定單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞緊密連接蛋白zo-1的分布,使用mmp2/9的特異抑制劑干預(yù),觀察上述指標(biāo)的改變情況。結(jié)果:雌激素增加子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,并呈劑量和時間依賴性,可被mmp-2/9抑制劑sb-3ct所抑制;隨雌激素誘導(dǎo)mmp-2/9表達(dá)水平上升及其活性的增強(qiáng),內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-5、zo-1表達(dá)水平下降,進(jìn)而使細(xì)胞之間的空隙增大,通透性增加,上述作用可被mmp-2/9抑制劑sb-3ct所抑制;動物整體和細(xì)胞水平研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)雌激素誘導(dǎo)vegf表達(dá)上調(diào),sb-3ct雖然可以抑制mmp-2/9的表達(dá)水平升高和活性增加,但不能抑制雌激素誘導(dǎo)vegf表達(dá)上調(diào);本研究發(fā)現(xiàn)阻斷mmp-2/9能高效阻斷雌激素引起的子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性的增加,為以mmp-2/9治療功血提供了新的藥物高效干預(yù)潛在靶點(diǎn)。結(jié)論:雌激素可通過誘導(dǎo)vegf生成,促進(jìn)mmp-2/9表達(dá),分解細(xì)胞緊密連接蛋白,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加,并可被mmp-2/9的抑制劑所抑制。第三部分adub血清標(biāo)志物篩選鑒定及其在月經(jīng)血中的表達(dá)目的:目前臨床診斷功血主要依據(jù)病史、超聲檢查以及子宮內(nèi)膜活檢,需排除生殖器官疾病或全身性疾病引發(fā)的生殖器官出血。患者從發(fā)病到確診可能經(jīng)歷較長的時間,延誤病情治療,給患者造成較大的痛苦。所以,如何早期篩查和診斷功血是功血研究的重要課題。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的新技術(shù)seldi對adub患者和正常婦女血清中的標(biāo)志蛋白進(jìn)行篩選。方法:應(yīng)用seldi對adub患者和正常婦女血清中的標(biāo)志蛋白進(jìn)行篩選,同時,采用tricine-sds-page膠分離、質(zhì)譜鑒定和免疫共沉淀對檢測到有差異的蛋白峰進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,并采用elisa、rt-pcr和western-blotting進(jìn)一步驗(yàn)證被鑒定的蛋白質(zhì)在功血患者和正常婦女月經(jīng)中的表達(dá)。結(jié)果:采用蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)-seld篩選adub的血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物,得到兩個差異蛋白峰,進(jìn)一步采用tricine-sds-page膠分離、質(zhì)譜鑒定和免疫共沉淀將它們鑒定為saa和vegf,通過elisa、rt-pcr、western-blotting檢測,確證saa在adub患者的月中表達(dá)上調(diào),而vegf在正常婦女的月經(jīng)中表達(dá)上調(diào),與seldi技術(shù)篩選的結(jié)果以及蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果一致。結(jié)論:saa和vegf是adub功血患者的重要血清標(biāo)志物。第四部分adub和odub血清蛋白標(biāo)志物的比較研究目的:從蛋白質(zhì)水平探索疾病的致病機(jī)理,更能直接地闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制,對adub和odub病人的血清標(biāo)志物進(jìn)行比較有可能找到其共同的血清標(biāo)志物。方法:應(yīng)用seldi技術(shù)對adub和odub患者及正常婦女血清中的標(biāo)志蛋白進(jìn)行篩選,同時,采用tricine-sds-page膠分離、質(zhì)譜鑒定和免疫共沉淀對檢測到有差異的蛋白峰進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,并采用elisa、rt-pcr和western-blotting進(jìn)一步驗(yàn)證被鑒定的蛋白質(zhì)在功血患者和正常婦女月經(jīng)中的表達(dá)。結(jié)果:應(yīng)用seldi-tof-ms技術(shù)篩選功能失調(diào)性子宮出血的血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物,得到3個差異蛋白峰,進(jìn)一步鑒定為saa、vegf和vkor,通過elisa、rt-pcr、western-blotting檢測,證實(shí)saa在adub和odub患者的月經(jīng)中表達(dá)上調(diào),vegf在adub患者的月經(jīng)中表達(dá)下調(diào),而vkor在odub患者的月經(jīng)中表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:saa是adub和odub兩類功血共同的血清標(biāo)志物。第五部分SAA對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響目的:探索功血血清標(biāo)志物SAA對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響,初步分析SAA在功血中的病理生理學(xué)意義。方法:MTT法分析細(xì)胞活力,并采用qRT-PCR、Western-blotting和ELISA分別檢測VEGF的mRNA、蛋白表達(dá)水平和分泌水平,細(xì)胞免疫組織化學(xué)測定vimenatin鑒定ESC細(xì)胞純度。結(jié)果:加SAA處理后,細(xì)胞連接松散,細(xì)胞貼壁能力差,部分細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮,脫落的細(xì)胞增多。但低濃度SAA對ESC的存活并無影響,當(dāng)SAA濃度達(dá)到60mg/L,ESC細(xì)胞的存活率顯著下降(P0.05,與對照組比較),且隨SAA濃度的升高,ESC細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降,當(dāng)SAA濃度達(dá)到200mg/L,對ESC細(xì)胞的存活率影響最大,SAA濃度達(dá)到400mg/L時與200mg/L無顯著性差異。低濃度(10mg/L)能升高VEGF的mRNA和蛋白及分泌水平,但隨著SAA濃度的升高,與對照組比較,VEGF的mRNA水平、蛋白水平、分泌水平均顯著下降,以40mg/L的效果最顯著。由以上結(jié)果可見,SAA在一定濃度范圍內(nèi)可濃度依賴性地下調(diào)VEGF基因的表達(dá)及分泌,低濃度SAA反而有上調(diào)VEGF基因表達(dá)的作用,這一點(diǎn)值得注意。由于20mg/L的SAA顯著下調(diào)VEGF的表達(dá),故取該濃度研究SAA調(diào)控VEGF表達(dá)的時間效用,可見在短時間內(nèi)VEGF表達(dá)水平顯著上升,但隨著時間的延長,其表達(dá)水平逐漸下降,36h和72h的表達(dá)水平顯著低于對照組。結(jié)論:高濃度SAA使ESC細(xì)胞的活力下降,在一定的濃度范圍內(nèi),SAA劑量和時間依賴地下調(diào)VEGF的表達(dá)。
[Abstract]:The expression of MMP - 2 / 9 and the expression of MMP - 2 / 9 in endometrial epithelial cells were studied by increasing the expression of MMP - 2 / 9 . The expression of MMP - 2 / 9 and the expression of MMP - 2 / 9 were investigated . The effect of estrogen on the expression of mmp - 2 / 9 and vegf in the endometrium of adub was investigated . 閫氶，

本文編號：1992399