本文選題：MRI + 胚胎　； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：出生缺陷問題已成為影響人口質(zhì)量的重要原因之一。引起出生缺陷的因素眾多,其中醫(yī)源性因素不容忽視。x射線、CT的等臨床診斷手段以及某些藥物(如抗腫瘤藥)已被證實(shí)有致畸、流產(chǎn)等影響,而像磁共振成像技術(shù)(Magnetic Resonance Imaging, MRI)目前還不確定對胚胎發(fā)育是否有影響。MRI是一種基于磁場,收集磁共振產(chǎn)生的信號并重建圖像的成像技術(shù),是繼CT后醫(yī)學(xué)影像學(xué)的又一重大進(jìn)步。 CT產(chǎn)生的電離輻射可引起原子構(gòu)象不可逆轉(zhuǎn)的改變,造成生物分子離子化或共價(jià)鍵的斷裂；MRI產(chǎn)生的電磁輻射只是改變了原子的位置,不會改變生物分子的結(jié)構(gòu)、組成、特性,因而被認(rèn)為是一種相對安全的成像技術(shù)。此外,MRI因其成像靈活性,病人易接受性,可同時(shí)評估病理性和生理性參數(shù),無創(chuàng)等特點(diǎn)已成為醫(yī)學(xué)成像的重要方法之一,被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、科學(xué)研究等方面,極大地推動了影像醫(yī)學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)和認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)的迅速發(fā)展。但在早期,因MRI成像速度慢,對動態(tài)物體易產(chǎn)生偽影,設(shè)備價(jià)格高昂等原因限制了該技術(shù)在婦產(chǎn)科領(lǐng)域,特別是產(chǎn)科的應(yīng)用,故未引起研究者對MRI技術(shù)對胎兒生長發(fā)育影響的足夠關(guān)注。如今,由于MRI技術(shù)本身的進(jìn)步、發(fā)展和普及,在婦產(chǎn)科領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛,并作為重要手段應(yīng)用于妊娠中、晚期產(chǎn)前診斷,為出生缺陷控制發(fā)揮了重要的作用。但也因其廣泛的使用,有越來越多的孕早期胚胎被不可避免地暴露于MRI環(huán)境下,包括亞臨床妊娠的婦女。因此,MRI對胚胎和早中孕期胎兒的安全性問題越來越受人關(guān)注。MRI的胚胎安全風(fēng)險(xiǎn)來源于三個(gè)方面：強(qiáng)大的靜磁場(Static Magnetic Fields,SMF)、隨時(shí)間變化的梯度磁場(Gradient Magnetic Field, GMF)及脈沖射頻磁場(Radio-Frequency Pulse, RFP)。其中,SMF的危害主要有生物學(xué)效應(yīng)、投射效應(yīng),GMF的可能危害主要有：噪聲、電生物效應(yīng)、外周神經(jīng)刺激等,而RFP主要危害是熱效應(yīng)。迄今,對MRI胚胎安全性的研究多為低、中強(qiáng)度SMF的單因素影響研究。GMF和RFP對胚胎影響的研究很少,三種不同磁場的疊加對胚胎影響的研究更少,且研究結(jié)果不盡一致,缺乏對三種磁場聯(lián)合效應(yīng)的綜合了解。而且隨著MRI技術(shù)不斷完善,為追求更高的空間分辨率、更短的掃描時(shí)間,更高強(qiáng)度的磁場必將會被應(yīng)用,故有關(guān)強(qiáng)磁場的安全性的研究刻不容緩。本研究以小鼠10.5dpc (days post coitus)為模型,短時(shí)間暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI,并通過胚胎宮內(nèi)發(fā)育指標(biāo)評估以及基于TMT標(biāo)記法和LC-MS/MS的蛋白組學(xué)法高通量篩選出受MRI暴露影響的差異表達(dá)蛋白,研究1.5TMRI對孕早期胚胎發(fā)育的影響；在此基礎(chǔ)上,通過分析重要分子的表達(dá)水平變化,進(jìn)一步從分子水平角度分析MRI暴露對胚胎發(fā)育過程中哪些重要生物分子的豐度有影響；在體外,我們通過分析細(xì)胞增殖、周期、遷移和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究工作狀態(tài)下的1.5TMRI暴露對細(xì)胞生理特性的影響。本研究旨在多角度探尋MRI對胚胎發(fā)育和細(xì)胞的影響以及分子機(jī)理,為臨床安全合理使用MRI技術(shù)提供更充分的科學(xué)依據(jù)。第一部分1.5T MRI暴露下胚胎宮內(nèi)發(fā)育及蛋白組學(xué)分析目的：以10.5dpc孕鼠為模型,短時(shí)間暴露工作狀態(tài)下1.5T MRI后通過測量胚胎宮內(nèi)發(fā)育指標(biāo)以及蛋白組學(xué)分析研究MRI暴露對胚胎發(fā)育的影響。方法：構(gòu)建10.5dpc孕鼠,暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min、30min、60min,于18.5dpc剖官測量鼠胚宮內(nèi)發(fā)育指標(biāo)；于暴露后4小時(shí)和24小時(shí)解剖孕鼠,提取胚胎總蛋白,進(jìn)行基于TMT標(biāo)記法和LC-MS/MS的蛋白組學(xué)分析。結(jié)果：1.10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min、30min、60min后,至18.5dpc剖官觀察鼠胚宮內(nèi)發(fā)育情況,發(fā)現(xiàn)均不影響著床總數(shù)、胎窩總重、胎盤總重,胚胎存活率、死亡率和吸收率,活胎胎重、身長和尾長等指標(biāo)。2.與對照組相比,1.5T MRI暴露15min、30min、60min后4小時(shí)收集的實(shí)驗(yàn)組蛋白水平上調(diào)2倍以上的分別有12個(gè)、15個(gè)、52個(gè),上調(diào)1.5倍以上的分別有104個(gè)、82個(gè)、162個(gè),下調(diào)1/2以上的分別有3個(gè)、1個(gè)、8個(gè),下調(diào)1/3以上的分別有43個(gè)、5個(gè)、124個(gè)；1.5T MRI暴露15min、30min、60min后24小時(shí)收集的實(shí)驗(yàn)組蛋白水平上調(diào)2倍以上的分別有36個(gè)、30個(gè)、26個(gè),上調(diào)1.5倍以上的分別有105個(gè)、128個(gè)、122個(gè),下調(diào)1/2以上的分別有17個(gè)、36個(gè)、44個(gè),下調(diào)1/3以上的分別有82個(gè)、193個(gè)、309個(gè)。3.取MRI暴露60min后24小時(shí)的鼠胚蛋白,蛋白組學(xué)篩選到122個(gè)上調(diào)1.5倍以上的差異表達(dá)蛋白,GO分析主要涉及的生物學(xué)過程有RNA剪切,mRNA代謝過程,心臟收縮,血液循環(huán)等,主要參與的信號通路有RNA剪接,心肌收縮,肥厚型心肌病(HCM),擴(kuò)張型心肌�。坏鞍捉M學(xué)篩選到309個(gè)下調(diào)1/3以上的差異表達(dá)蛋白,GO分析主要涉及的生物學(xué)過程有轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分裂、蛋白代謝、RNA代謝等,主要參與的信號通路泛素化介導(dǎo)的蛋白降解、亨廷頓、細(xì)胞周期等。結(jié)論：1.10.5dpc小鼠胚胎暴露于1.5TMRI 15min,30min,60min后均未發(fā)現(xiàn)著床總數(shù)、胎窩總重、胎盤總重,胚胎存活率、死亡率和吸收率,活胎胎重、身長和尾長等指標(biāo)的改變。2.蛋白組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)MRI暴露導(dǎo)致眾多的差異表達(dá)蛋白,這些差異表達(dá)蛋白參與的信號通路主要有RNA剪接、泛素化介導(dǎo)的蛋白降解途徑等,這些信號通路在胚胎發(fā)育、機(jī)體功能建立和維持方面均有重要作用。第二部分1.5T MRI暴露對小鼠胚胎鈣調(diào)蛋白和剪接因子影響的分析目的：利用傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白組學(xué)鑒定到的胚胎短期暴露在工作狀態(tài)下的1.5TMRI后差異表達(dá)的重要分子鈣調(diào)蛋白和部分剪接因子的差異表達(dá)情況。方法：構(gòu)建10.5dpc孕鼠,暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min、30min、60min,于暴露后4小時(shí)和24小時(shí)解剖孕鼠,通過熒光定量PCR和Western blot等方法驗(yàn)證鈣調(diào)蛋白和剪接因子的差異表達(dá)情況。結(jié)果：1.熒光定量PCR結(jié)果顯示,10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min、 30min、60min,于暴露后24小時(shí)解剖孕鼠,發(fā)現(xiàn)同時(shí)表達(dá)鈣調(diào)蛋白的三個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平均有顯著上調(diào)。2.10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min,30min,60min,于暴露后4小時(shí)和24小時(shí)解剖孕鼠,經(jīng)蛋白組學(xué)鑒定到59個(gè)具有重要分子功能的剪接因子或與剪接相關(guān)的蛋白分子,熱圖分析發(fā)現(xiàn)MRI暴露后4小時(shí)獲取的胚胎組織相比,24小時(shí)獲取的胚胎組織的剪接因子蛋白質(zhì)相對變化水平更顯著,其中24小時(shí)獲取的胚胎組織組中有25個(gè)剪接因子差異表達(dá)增加在1.2倍以上。3.選取其中8個(gè)基因(SCAF11, SR3B6, SRSF1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRSF7)作熒光定量PCR鑒定,結(jié)果顯示10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5TMRI 15min、30min、60min,于暴露后24小時(shí)解剖孕鼠,這8個(gè)基因均有一定程度轉(zhuǎn)錄水平上升,其中Sf3b6和Srsf7的30min和60mmin組與對照組相比基因轉(zhuǎn)錄水平有顯著差異,Srsf5和Srsf7的15min組與對照組相比基因轉(zhuǎn)錄水平有顯著差異。4.選取SRSF1,SRSF3, SRSF4和SRSF64個(gè)蛋白作Western blot鑒定,結(jié)果顯示10.5dpc孕鼠暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI 15min,30min,60min,于暴露后24小時(shí)解剖孕鼠,這四個(gè)蛋白均有顯著降低。5. 收取不同時(shí)期(9.5/10.5/11.5/12.5/13.5/14.5/15.5/16.5/17.5dpc)小鼠胚胎組織,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)9.5dpc時(shí),SRSF1, SRSF3和SRSF6的蛋白表達(dá)均較弱,而SRSF4相對處于較高的豐度。在10.5dpc至14.5dpc期間,SRSF1, SRSF3, SRSF4和SRSF6均保持在相對穩(wěn)定且表達(dá)水平較高的階段,之后蛋白的表達(dá)水平均有不同程度下調(diào)。6.將10.5dpc孕鼠暴露于MRI下60min,并在MRI暴露后12h/24h/48h/72h時(shí)期收集小鼠胚胎組織,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)SRSF1, SRSF3, SRSF4和SRSF6的蛋白水平MRI暴露后一定時(shí)間內(nèi)均能有所恢復(fù),其中SRSF1和SRSF3在MRI暴露后24小時(shí)蛋白下降顯著,并在48小時(shí)顯著恢復(fù)；SRSF4在MRI暴露后12小時(shí)即開始下降,24小時(shí)有一定程度恢復(fù),而在48小時(shí)顯著恢復(fù)；SRSF6在MRI暴露后48小時(shí)呈顯著下調(diào),在72小時(shí)有一定程度恢復(fù)。結(jié)論：1.10.5dpc小鼠胚胎暴露于工作狀態(tài)下1.5TMRI 60min,可引起鈣調(diào)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),提示MRI暴露可能干擾了胚胎組織鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。2.選取其中八個(gè)剪接因子的基因做熒光定量PCR驗(yàn)證,提示小鼠胚胎組織經(jīng)過MRI暴露后部分剪接因子的表達(dá)發(fā)生變化,這有可能影響胚胎組織可變剪接的調(diào)控過程,甚至影響胚胎發(fā)育。3. Western blot檢測發(fā)現(xiàn)SRSF1, SRSF3, SRSF4和SRSF6的蛋白水平在MRI暴露后24小時(shí)均有下降并在暴露后一定時(shí)間內(nèi)有所恢復(fù),提示在分子水平MRI短期暴露對胚胎確有一定影響,且這種影響是可逆的。4. SRSF1, SRSF3, SRSF4和SRSF6蛋白水平在胚胎發(fā)育不同時(shí)期高度動態(tài),提示其蛋白水平根據(jù)胚胎發(fā)育狀況和階段嚴(yán)格受到機(jī)體嚴(yán)密調(diào)控,在胚胎發(fā)育某階段蛋白水平上調(diào)或下調(diào)均有可能影響胚胎的正常發(fā)育。第三部分1.5T MRI暴露對細(xì)胞生理特性的影響目的：為進(jìn)一步研究工作狀態(tài)下1.5TMRI的生物學(xué)效應(yīng),我們在細(xì)胞水平通過檢測細(xì)胞增殖、周期、遷移、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等生理特性的改變?yōu)樯钊胙芯刻接慚RI安全性提供理論依據(jù)。方法：利用自制恒溫箱實(shí)現(xiàn)細(xì)胞短期暴露于工作狀態(tài)下1.5T MRI,通過流式細(xì)胞術(shù)、WST-1法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和透射電子顯微鏡檢測細(xì)胞在MRI暴露后周期、增殖、遷移以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等的變化情況。結(jié)果：1.WST-1法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示,經(jīng)MRI暴露60min后的Swan71細(xì)胞生長較對照組細(xì)胞生長明顯減慢,差異在暴露后24h開始體現(xiàn),第48h兩組生長速度差異顯著(P=0.005634),第96h兩組細(xì)胞密度相差一倍,P=0.00007。2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,MRI暴露60min后Swan71細(xì)胞周期分布與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.5)。3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SiHa細(xì)胞在MRI暴露60mmin后細(xì)胞遷移速度相比于對照組有明顯減慢。隨機(jī)統(tǒng)計(jì)對照組20個(gè)位置細(xì)胞的遷移情況,發(fā)現(xiàn)24小時(shí)后平均遷移65.271μm,而隨機(jī)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組22個(gè)位置的細(xì)胞遷移情況,發(fā)現(xiàn)24小時(shí)候平均遷移45.94μm,兩組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)4.透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,經(jīng)MRI暴露60min后的Swan71細(xì)胞核輕度固縮,核周隙存在,核仁輕度團(tuán)聚；線粒體腫脹明顯,變大變圓,質(zhì)膜完整,基質(zhì)變淺、嵴變短變少;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未擴(kuò)張成囊狀或者小泡。結(jié)論：1.1.5T MRI暴露60mmin后降低人滋養(yǎng)細(xì)胞Swan71的細(xì)胞增殖速度,但并不影響細(xì)胞周期分布。2.1.5T MRI暴露60mmin后降低SiHa細(xì)胞的遷移能力。3.1.5T MRI暴露60min后影響人滋養(yǎng)細(xì)胞Swan71的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),引起細(xì)胞線粒體腫脹。
[Abstract]:Birth defects have become one of the most important factors that affect the quality of population . The factors that cause birth defects are numerous , such as X - ray , CT and so on . Magnetic Resonance Imaging ( MRI ) has been proved to have influence on embryonic development . MRI is a magnetic resonance imaging technique that collects signals generated by magnetic resonance and reconstructs image , which is another important progress in medical imaging following CT . The ionizing radiation produced by CT can cause irreversible changes in atomic conformation , resulting in the ionization or covalent bond of biomolecules ;
MRI浜х敓鐨勭數(shù)紓佽緪灝勫彧鏄敼鍙樹簡鍘熷瓙鐨勪綅緗，

本文編號：1973892