本文選題：宮頸癌 + c-Fos　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的 宮頸癌中常伴有c-Fos過(guò)表達(dá)，c-Fos過(guò)表達(dá)與其侵襲能力有關(guān)。本研究的主要目的是通過(guò)生物信息學(xué)工具對(duì)c-Fos進(jìn)行microRNA預(yù)測(cè)，研究microRNA對(duì)其的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，通過(guò)過(guò)表達(dá)候選microRNA檢測(cè)其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為的影響。 方法 通過(guò)生物信息學(xué)工具對(duì)c-Fos3'UTR展開進(jìn)化保守性分析。同時(shí)利用生物信息學(xué)網(wǎng)站進(jìn)行microRNA預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)選定的microRNA所結(jié)合的種子序列進(jìn)行保守性分析。在所有預(yù)測(cè)的microRNA中選定一個(gè)作為研究對(duì)象。為探討選定的microRNA能否直接作用于c-Fos基因mRNA的3'UTR，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。在確認(rèn)該候選microRNA可轉(zhuǎn)錄后調(diào)控c-Fos基因后，該microRNA的擬似物mimic被轉(zhuǎn)染入宮頸癌HeLa細(xì)胞，檢測(cè)在蛋白和mRNA水平，該microRNA對(duì)于c-Fos的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)被用于檢測(cè)該microRNA對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期以及凋亡的調(diào)控作用；EdU染色用于檢測(cè)過(guò)表達(dá)備選microRNA對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響；此外，劃痕實(shí)驗(yàn)被用于檢測(cè)過(guò)表達(dá)候選microRNA對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響。 結(jié)果 生物學(xué)保守性分析顯示c-Fos基因的3’UTR在哺乳動(dòng)物進(jìn)化中高度保守。利用microRNA在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)c-Fos基因的靶向microRNA進(jìn)行了預(yù)測(cè)。在所有預(yù)測(cè)的microRNAs中，通過(guò)文獻(xiàn)查閱、對(duì)種子序列的保守性分析篩選后，miR-101被選定進(jìn)行后續(xù)研究。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)：miR-101可以結(jié)合c-Fos3’UTR特定種子序列，并調(diào)節(jié)上游熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染miR-101mimic后c-Fos的mRNA表達(dá)同對(duì)照組比較明顯降低，Western blot結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染miR-101mimic后c-Fos蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較明顯下降，以上結(jié)果表明miR-101能直接作用于c-Fos的3' UTR并在mRNA水平和蛋白水平轉(zhuǎn)錄后下調(diào)c-Fos的表達(dá)。 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，，相對(duì)于陰性對(duì)照組和c-Fos過(guò)表達(dá)恢復(fù)組，miR-101實(shí)驗(yàn)組對(duì)HeLa細(xì)胞周期有明顯影響，實(shí)驗(yàn)組HeLa細(xì)胞的G1期相對(duì)延長(zhǎng)，總S期下降，該結(jié)果能表明miR-101能抑制宮頸癌細(xì)胞的G1-to-S期轉(zhuǎn)變。 EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)以及流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)證明過(guò)表達(dá)miR-101能抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，但對(duì)凋亡無(wú)明顯影響。 細(xì)胞遷移劃痕實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)miR-101能有效抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移能力。 結(jié)論 生物信息學(xué)分析表明：c-Fos在哺乳動(dòng)物進(jìn)化中高度保守，miR-101所結(jié)合的種子序列在哺乳動(dòng)物進(jìn)化中高度保守，miR-101能與其結(jié)合的種子序列堿基互補(bǔ)配對(duì)，故miR-101在理論上有可能轉(zhuǎn)錄后調(diào)控c-Fos的表達(dá)。Luciferase assay結(jié)果表明miR-101能與c-Fos的3’非翻譯區(qū)結(jié)合；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示miR-101能在mRNA水平調(diào)控c-Fos的表達(dá)；Western blot證實(shí)了miR-101有效下調(diào)c-Fos蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-101顯著降低了宮頸癌HeLa細(xì)胞的總S期，抑制了宮頸癌HeLa細(xì)胞的G1-to-S期轉(zhuǎn)變；EdU增殖檢測(cè)顯示過(guò)表達(dá)miR-101能有效遏制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖；同時(shí)能抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移能力。以上研究結(jié)果表明miR-101可作為一種腫瘤抑制microRNA能對(duì)宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移產(chǎn)生明顯影響，從而在宮頸癌中發(fā)揮腫瘤抑制的作用。本研究將可能對(duì)宮頸癌的治療提供一條新的思路。
[Abstract]:Purpose

The main aim of this study was to investigate the effect of microRNA on the proliferation , apoptosis and migration of cervical cancer HeLa cells by means of bioinformatics tools .

method

In order to investigate whether the selected microRNA can be directly applied to the 3 ' untranslated region of c - fos gene , a double luciferase reporter system is selected as the research object . After confirming that the selected microRNA can be directly used for regulating the c - fos gene , the proposed microRNA can be transfected into the cervical cancer HeLa cell to detect the post - transcriptional regulation effect of the microRNA on the c - fos . Flow cytometry is used for detecting the cell cycle of the microRNA to HeLa cells and the regulation of apoptosis ;
EdU staining was used to detect the effect of overexpression of alternative microRNA on proliferation of HeLa cells ;
In addition , the scratch test was used to detect the effect of overexpression of candidate microRNA on HeLa cell migration ability .

Results

In all the predicted microRNAs , miR - 101 can bind to the specific seed sequence of c - Fos3 ' , and adjust the transcription level of the upstream luciferase gene .

The results of real - time fluorescence quantitative PCR showed that the expression of c - fos after transfected with miR - 101 was significantly lower than that of the control group , and Western blot showed that the expression of c - fos protein was significantly decreased compared with the control group after transfected with miR - 101 .

The cell cycle of HeLa cells was detected by flow cytometry . The results showed that miR - 101 had a significant effect on the cell cycle of HeLa cells compared with the negative control group and the c - fos overexpression recovery group . The G1 phase of HeLa cells in the experimental group was relatively prolonged and the total S phase decreased , and the results indicated that miR - 101 can inhibit the G1 - to - S phase transition of cervical cancer cells .

EdU cell proliferation assay and flow cytometry demonstrated that miR - 101 inhibited the proliferation of cervical cancer HeLa cells , but had no significant effect on apoptosis .

Cell migration and scratch test indicated that miR - 101 can effectively inhibit the migration ability of cervical cancer HeLa cells .

Conclusion

Bioinformatic analysis shows that c - fos is highly conserved in mammalian evolution , and that miR - 101 is highly conserved in mammalian evolution , and miR - 101 is complementary to the base complement of the seed sequence associated with miR - 101 , so miR - 101 is theoretically possible to regulate the expression of c - fos after transcription . The results of Lucifer assay indicate that miR - 101 can bind to the 3 ' untranslated region of c - fos ;
Real - time fluorescence quantitative PCR results show that miR - 101 can regulate the expression of c - fos at mRNA level ;
Western blot demonstrated that miR - 101 downregulated the expression of c - fos protein .
Flow cytometry showed that miR - 101 significantly reduced the total S phase of cervical cancer HeLa cells and inhibited the G1 - to - S phase transition of cervical cancer HeLa cells .
The proliferation test of EdU shows that miR - 101 can effectively inhibit the proliferation of cervical cancer HeLa cells ;
The results show that miR - 101 can play a role in inhibiting the cell cycle , cell proliferation and cell migration of cervical cancer cells .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.33

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1960138