本文選題：人正常宮頸上皮細(xì)胞 + 中性蛋白酶��； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：原代培養(yǎng)相比于臨床上常用的細(xì)胞株更好地保留了細(xì)胞的原始生物學(xué)特性,更能反映體內(nèi)細(xì)胞的生理病理狀態(tài),故利用原代細(xì)胞為基礎(chǔ)探索相關(guān)疾病及其發(fā)病機(jī)制已成為體外研究的一種理想工具,越來(lái)越受到人們的重視。近年來(lái),生物醫(yī)學(xué)各種以正常原代細(xì)胞為基礎(chǔ)的研究逐年增多,各種組織的原代培養(yǎng)的相關(guān)研究逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)對(duì)于深入研究人類乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)在宮頸癌中的作用機(jī)制至關(guān)重要。然而,對(duì)于正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的研究很少,急需尋找一種高效、可重復(fù)性高的宮頸細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)的方法。宮頸原代上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)常見的方法有組織塊培養(yǎng)法和酶消化后培養(yǎng)法。組織塊培養(yǎng),雖然操作簡(jiǎn)便,但細(xì)胞培養(yǎng)成功率較低,容易導(dǎo)致成纖維細(xì)胞和微生物的污染。酶消化法能夠特異性的消化相應(yīng)細(xì)胞,使組織分離為單細(xì)胞懸液,比組織塊法更加高效,但對(duì)細(xì)胞易造成損傷而影響細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量。分離原代細(xì)胞常用的消化酶有胰酶、?型膠原酶、Ⅱ型中性蛋白酶聯(lián)合胰酶,培養(yǎng)基主要有單純無(wú)血清培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加EGF、胰島素、氫化可的松等生長(zhǎng)因子,然而不管是目的細(xì)胞分離技術(shù)還是培養(yǎng)基成分的選擇都均存在欠缺,如:分離步驟繁瑣、細(xì)胞純度不高、細(xì)胞活性欠佳等�；诓《镜霓D(zhuǎn)染方法已成為實(shí)現(xiàn)難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞和細(xì)胞系的基因表達(dá)最成功的方法,幾乎適用于所有類型的細(xì)胞和原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,成為了外源基因感染細(xì)胞最有效的工具。病毒載體的合理選用對(duì)保證病毒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效果至關(guān)重要,其中,慢病毒載體(lentivirus vector,LV)介導(dǎo)的外源基因的轉(zhuǎn)染,能夠轉(zhuǎn)染分裂和非分裂期細(xì)胞,并且能夠與宿主基因組發(fā)生整合,維持長(zhǎng)久的基因表達(dá)能力,使得慢病毒載體為外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的體外研究提供了一個(gè)新的平臺(tái)。本研究的目的在于通過不同的酶消化分離方法、不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)的比較,建立一種更優(yōu)的原代正常宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系。并利用重組慢病毒感染原代宮頸細(xì)胞,初步建立一個(gè)感染HPV E6的體外細(xì)胞模型,為后續(xù)原代宮頸細(xì)胞感染HPV的致癌機(jī)制的研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。方法1.本研究的所有標(biāo)本均來(lái)源于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院2015年9月至2016年9月婦科住院部因良性子宮病變(如多發(fā)性子宮肌瘤、子宮腺肌癥等)進(jìn)行子宮全切術(shù)患者的正常宮頸組織,年齡38-60歲(中位年齡46歲)。患者及家屬均知情同意并簽署同意書。所有標(biāo)本術(shù)前檢查HPV及液基細(xì)胞學(xué)(Liquid based cytology,LBC)均陰性,術(shù)后組織病理學(xué)結(jié)果證實(shí)宮頸組織無(wú)異常病變。本研究共收集標(biāo)本90例,分為2組,一組為Ⅱ型中性蛋白酶聯(lián)合0.25%胰酶-EDTA組45例,另一組為?型膠原酶組45例,分別進(jìn)行宮頸組織的分離及原代培養(yǎng)。2.分別采用Ⅱ型中性蛋白酶聯(lián)合0.25%胰酶-EDTA及?型膠原酶消化分離細(xì)胞后進(jìn)行原代培養(yǎng),比較兩種酶的分離效果,以及中性蛋白酶聯(lián)合法不同消化時(shí)間對(duì)分離效果的影響;通過生長(zhǎng)曲線比較添加5%FBS的d KSFM培養(yǎng)基與單獨(dú)d KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)原代宮頸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)效果,并通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn),及免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞熒光角蛋白染色共同鑒定細(xì)胞來(lái)源。3.體外擴(kuò)增HPV16 E6基因,經(jīng)酶切連接到慢病毒載體上,構(gòu)建重組慢病毒載體并通過293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝,感染原代人正常宮頸上皮細(xì)胞。感染48h后倒置熒光顯微鏡下觀察HPV16 E6基因綠色熒光蛋白(cop GFP)熒光表達(dá),q RT-PCR檢測(cè)感染后HPV16 E6 mRNA的表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。以?x±s表示實(shí)驗(yàn)的計(jì)量資料,采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩種分離方法的成功率和細(xì)胞純度的比較,采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分離細(xì)胞密度、原代細(xì)胞融合時(shí)間、細(xì)胞貼壁率的比較。中性蛋白酶不同消化時(shí)間對(duì)分離效果的比較采用方差分析或非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn),兩兩比較采用Boffrroni檢驗(yàn)。采用兩獨(dú)立樣本定量資料t檢驗(yàn)進(jìn)行兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活性(OD值)的比較。采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行感染組、感染對(duì)照組、未感染組間HPV16E6 mRNA表達(dá)水平的差異分析,組間比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.正常宮頸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)總成功率為42.2%。Ⅱ型中性蛋白酶聯(lián)合消化法成功率高于?型膠原酶法(P0.05),分離所得細(xì)胞密度、原代細(xì)胞融合時(shí)間、細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞純度均高于?型膠原酶消化法(P0.001)。中性蛋白酶消化20h的分離效果優(yōu)于消化16h和24h(P均0.001)。5%FBS d K-SFM培養(yǎng)基原代培養(yǎng)宮頸上皮細(xì)胞增殖活性高于單純d K-SFM培養(yǎng)基(P0.05)。培養(yǎng)的原代正常宮頸細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好,細(xì)胞融合時(shí)呈典型鋪路石樣形態(tài),可在體外傳代至5代～6代,并可凍存與復(fù)蘇,免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫細(xì)胞熒光結(jié)果均顯示95%以上細(xì)胞廣譜角蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)。2.重組慢病毒EB-cop GFP(T2A)puro-E6感染原代正常宮頸細(xì)胞48h后,倒置熒光顯微鏡下觀察可見感染組細(xì)胞胞漿內(nèi)大量綠色熒光蛋白(cop GFP)表達(dá);空的慢病毒EB-cop GFP(T2A)puro感染原代宮頸細(xì)胞也可見cop GFP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞;未感染細(xì)胞無(wú)熒光信號(hào)。普通倒置顯微鏡下,感染前后細(xì)胞形態(tài)相似,細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化。3.q RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,HPV E6 mRNA在感染組、感染對(duì)照組和未感染組的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.2,P0.05)。其中,HPV E6 mRNA在感染組的表達(dá)水平高于感染對(duì)照組及未感染組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.017)。結(jié)論1.Ⅱ型中性蛋白酶消化20h聯(lián)合胰酶法進(jìn)行細(xì)胞分離,5%FBS d KSFM培養(yǎng)基可高效進(jìn)行正常宮頸細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng),并可以凍存與復(fù)蘇;2.成功采用重組HPV E6基因慢病毒感染原代正常宮頸上皮細(xì)胞,為慢病毒介導(dǎo)其他外源基因?qū)υ鷮m頸細(xì)胞的導(dǎo)入和宮頸癌發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The primary culture of normal cervical epithelial cells has become an ideal tool for studying human papillomavirus ( HPV ) in cervical cancer . In this study , we have established an in vitro cell model of human cervical epithelial cells infected with HPV E6 by different enzymatic digestion and separation methods . The expression level of HPV16 E6 mRNA was determined by means of non - parametric Kruskal - test . The results showed that the ratio of cell density , primary cell fusion time , cell adhesion rate and cell purity were significantly higher than that in normal cervical epithelial cells ( P0.05 ) . Conclusion The expression level of HPV E6 mRNA in the infected group is higher than that in the infected control group and the non - infected group ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Louise T.Chow;;Model systems to study the life cycle of human papillomaviruses and HPV-associated cancers[J];Virologica Sinica;2015年02期

2 江靜;鄧齊;馬營(yíng)營(yíng);趙昕;劉淳;;成人宮頸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及影響因素[J];中國(guó)婦幼保健;2014年10期

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本文編號(hào)：1959951