本文選題：妊娠糖尿病 + 胎盤��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文

【摘要】：妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是指妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的任何程度的糖耐量受損,包含了部分妊娠前已患有糖尿病但孕期首次被診斷的患者。GDM臨床經(jīng)過復雜,容易造成多種不良結(jié)局,對母嬰有嚴重的危害甚至有長遠的影響。目前關(guān)于GDM的發(fā)病機制尚不明確,已有的研究表明,GDM的病因是多源性的,可能是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度為18-23個核苷酸的,進化過程中高度保守的,在表觀遺傳學水平發(fā)揮負調(diào)控作用的單鏈小分子非編碼RNA。近年來的研究發(fā)現(xiàn)越來越多的miRNAs在GDM發(fā)病過程中起了重要作用。胎盤是唯一連接母胎的界面,是母胎物質(zhì)交換的場所,因此成為研究GDM這類糖代謝異常疾病發(fā)病機制的重要器官。為了探索在GDM中,miRNAs的分子生物學調(diào)控機制,前期我們利用miRNAs芯片篩選了在GDM和正常胎盤中差異表達的miRNAs。在本研究中我們利用qRT-PCR和原位雜交在GDM和正常人群樣本中進行驗證。對于差異表達的miRNAs,采用生物信息學預測其靶基因,并通過構(gòu)建靶基因的3'非翻譯區(qū)表達質(zhì)粒在雙熒光素酶報告系統(tǒng)中驗證候選miRNAs對其靶基因表達的調(diào)控。利用候選miRNAs及其靶基因的過表達、敲低及恢復實驗,研究候選miRNA通過靶基因?qū)μケP來源的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞細胞增殖、活性、凋亡、遷移和侵襲等功能的影響。根據(jù)miRNAs芯片結(jié)果,我們選擇了 let-7b、miR-1202和miR-29b 3個差異表達的miRNAs利用qRT-PCR在大規(guī)模的人群中進行驗證,結(jié)果顯示miR-29b在GDM中的表達水平顯著低于正常對照,年輕正常產(chǎn)婦的表達水平顯著高于年齡較大的產(chǎn)婦。原位雜交結(jié)果顯示miR-29b定位于胎盤滋養(yǎng)層細胞。MiR-29b過表達可以抑制細胞增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡;MiR-29b敲低可以促進細胞遷移和侵襲。為了研究miR-29b發(fā)揮作用的分子機制,我們通過miRBase和TargetScan預測了 miR-29b的靶基因,篩選出了 3個與糖尿病和GDM相關(guān)的候選miR-29b靶基因:ING2、ING3和HIF3A。雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析顯示miR-29b模擬物與HIF3A 3'-UTR共轉(zhuǎn)染細胞,可以降低熒光素酶活性;MiR-29b抑制劑與HIF 3'-UTR共轉(zhuǎn)染細胞可以升高熒光素酶活性;而miR-29b模擬物或抑制劑與ING2或INNG3 3'-UTR共轉(zhuǎn)染細胞,對熒光素酶活性沒有顯著影響。這些結(jié)果提示了HIF3 可能是miR-29b的靶基因。為了進一步驗證二者的關(guān)系,我們將HIF3'-UTR上miR-29b的識別、結(jié)合位點突變,發(fā)現(xiàn)其突變后與miR-29b的結(jié)合能力顯著降低。同時,我們利用Western blot分析了 miR-29b對內(nèi)源性靶基因表達的影響,結(jié)果顯示miR-29b可以反向調(diào)節(jié)HIF3A的表達,這些結(jié)果證實了HIF3 是miR-29b的靶基因。HIF3A過表達可以促進細胞增殖、遷移和侵襲抑制細胞凋亡;HIF3A敲低可以抑制細胞遷移和侵襲。為了研究HIF3A是否為miR-29b功能性的靶基因,我們利用基因補償實驗分析了 miR-29b和其靶基因?qū)毎飳W行為的影響。當滋養(yǎng)層細胞HTR8-/SVneo過表達miR-29b,補充外源性的HIF3A可以拮抗miR-29b過表達引起的細胞增殖、遷移和侵襲抑制;當HTR8-/SVneo低表達miR-29b,抑制內(nèi)源性HIF3A表達可以使細胞遷移和侵襲基本恢復正常水平。本研究的結(jié)果顯示在GDM胎盤中miR-29b表達水平降低,其通過上調(diào)HIF3A的表達,促進胎盤滋養(yǎng)層細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究從分子流行病學的角度研究了 miR-29b與GDM的相關(guān)性。同時,也確定了 miR-29b對胎盤來源的滋養(yǎng)層細胞功能的影響。
[Abstract]:Gestational diabetes mellitus (GDM) refers to any degree of impaired glucose tolerance that occurs for the first time or found during pregnancy. It includes the complication of.GDM in the patients who have been diagnosed with diabetes before pregnancy but the first diagnosis of pregnancy. It is easy to cause a variety of bad knot, serious harm to mother and baby and even a long-term shadow. The pathogenesis of GDM is not yet clear. Previous studies have shown that the etiology of GDM is multisource and may be the result of the combination of genetic and environmental factors. Small RNA (microRNA, miRNA) is a class of 18-23 nucleotides, highly conserved during evolution, and plays a negative regulatory role at epigenetic level. The study of single strand small molecule non coding RNA. in recent years has found that more and more miRNAs plays an important role in the pathogenesis of GDM. The placenta is the only interface connecting the mother fetal and the place for the exchange of maternal fetal substances. Therefore, it has become an important organ for the study of the pathogenesis of GDM, such as glucose metabolism disorder. In order to explore the molecular birth of miRNAs in GDM. We used miRNAs chip to screen the differentially expressed miRNAs. in GDM and normal placenta at the early stage. In this study, we used qRT-PCR and in situ hybridization to verify the GDM and normal population samples. For differentially expressed miRNAs, the target gene was predicted by bioinformatics and the 3'non reversal of the target gene was constructed. The expression plasmid in the double luciferase reporter system validates the regulation of the candidate miRNAs for the target gene expression in the double luciferase reporter system. Using the overexpression of the candidate miRNAs and its target gene, the knockdown and recovery experiments are used to study the function of the candidate miRNA on the proliferation, activity, apoptosis, migration and invasion of human chorionic trophoblast cells from the placental source by the target gene. Effect. According to the results of miRNAs chip, we selected 3 differentially expressed miRNAs of let-7b, miR-1202 and miR-29b to use qRT-PCR to verify in a large population. The results showed that the expression level of miR-29b in GDM was significantly lower than that of normal control. The expression of young normal women was significantly higher than that of older women. In situ hybridization node was significantly higher than that of older women. The results show that the overexpression of miR-29b in placental trophoblast cells.MiR-29b can inhibit cell proliferation, migration and invasion, and promote cell apoptosis; MiR-29b knockdown can promote cell migration and invasion. In order to study the molecular mechanism of miR-29b, we have predicted the target gene of miR-29b through miRBase and TargetScan, and screened 3 of them. The candidate miR-29b target genes related to diabetes and GDM: ING2, ING3 and HIF3A. double luciferase reporter system analysis showed that the miR-29b mimics and HIF3A 3'-UTR co transfected cells could reduce the luciferase activity, and MiR-29b inhibitors and HIF 3'-UTR co transfected cells could increase the luciferase activity; miR-29b analogue or inhibitor was associated with the HIF3A 3'-UTR. NNG3 3'-UTR co transfected cells have no significant effect on luciferase activity. These results suggest that HIF3 may be the target gene for miR-29b. In order to further verify the relationship between the two, we identified the miR-29b identification on HIF3'-UTR and the mutation of the binding site, and found that the binding capacity of the miR-29b was significantly reduced after the mutation. At the same time, we used Western. Blot analyzed the effect of miR-29b on the expression of endogenous target genes. The results showed that miR-29b could reverse the expression of HIF3A. These results confirm that HIF3 is the target gene.HIF3A overexpression of miR-29b, which can promote cell proliferation, migration and invasion to inhibit cell apoptosis; HIF3A knockdown can inhibit cell migration and invasion. In order to study HIF3A, As a target gene for miR-29b function, we used gene compensation experiments to analyze the effect of miR-29b and its target gene on cell biological behavior. When the trophoblast HTR8-/SVneo overexpressed miR-29b, supplementation of exogenous HIF3A could antagonize cell proliferation, migration and invasion inhibition caused by miR-29b overexpression; when HTR8-/SVneo was low in expression of miR- 29b, inhibiting the expression of endogenous HIF3A can make cell migration and invasion basically restored to normal levels. The results of this study showed that the level of miR-29b expression in GDM placenta decreased, and it promoted the proliferation, migration and invasion of placental trophoblast cells by up regulation of HIF3A expression. This study studied miR-29b and GDM from the molecular epidemiology point of view. At the same time, we also confirmed the effect of miR-29b on the function of trophoblast cells from placenta.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714.256

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本文編號：1952353