本文選題：自然流產(chǎn) + 絨毛組織��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：自然流產(chǎn)是常見的病理妊娠,其發(fā)生率在國內(nèi)外均較高。國內(nèi)的發(fā)生率可達(dá)全部妊娠的10～15%,且其中80%以上的自然流產(chǎn)發(fā)生在孕早期(孕12周以內(nèi))。誘發(fā)自然流產(chǎn)的原因復(fù)雜,涉及遺傳、免疫、內(nèi)分泌、生殖道解剖異常、感染、創(chuàng)傷,甚至環(huán)境等其他未知因素。在目前的檢查和醫(yī)療技術(shù)條件下,仍有高達(dá)60～70%的自然流產(chǎn)者無法找到確切的病因。 經(jīng)傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)觀察(核型分析),在15孕周的自然流產(chǎn)中,約有一半以上的自然流產(chǎn)胚胎存在染色體異常。本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明,染色體異常占早期自然流產(chǎn)的53.3%(88/165),但其中46.7%(77/165)的核型正常者找不到明確的病因。因此,有必要就自然流產(chǎn)的病因及其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探索。 表觀遺傳學(xué)是指在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下,基因的功能發(fā)生了可遺傳變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。DNA甲基化是表觀遺傳信息的最主要形式,哺乳動物基因組DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase, Dnmt)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到DNA分子中胞嘧啶殘基的5位碳原子上生成5-甲基胞嘧啶(5-dmC)的過程。不僅5-甲基胞嘧啶的多少可直接反應(yīng)DNA的甲基化程度,而且正常的DNA甲基化模式對哺乳動物的生長發(fā)育也至關(guān)重要。其通過基因印跡、基因沉默和女性X染色體失活等作用在胚胎發(fā)育早期建立的特異性甲基化模式,可在胚胎發(fā)育和增殖過程中穩(wěn)定傳遞,并影響著個(gè)體整個(gè)的生長和發(fā)育過程。所以,理論上推測,DNA甲基化的異常有可能與自然流產(chǎn)存在著某種相關(guān)性。 然而,對DNA甲基化水平的研究現(xiàn)多集中于各種腫瘤上,如胃癌、結(jié)腸癌等。關(guān)于DNA甲基化水平與自然流產(chǎn)關(guān)系的研究報(bào)道迄今為止僅有2篇。一篇是1983年Cezar等為了弄清整個(gè)基因組甲基化水平和克隆胚胎發(fā)育能力之間的關(guān)系,對9例自然流產(chǎn)克隆牛胎兒、7例成活的克隆牛胎兒以及11例健康成年克隆牛的整個(gè)基因組甲基化水平的研究。另一篇是Li-Jun Y等人在2012年為分析自然流產(chǎn)中的DNA甲基化水平的作用,分別對16例自然流產(chǎn)絨毛和16例人工流產(chǎn)絨毛DNA甲基化水平及其Dnmtl、 Dnmt3a的表達(dá)所做的測定比較。結(jié)果都顯示DNA甲基化水平可能與自然流產(chǎn)有關(guān)。但由于相關(guān)的研究報(bào)道數(shù)量極為有限,且樣本量過少,因此,DNA甲基化水平與不明原因早期自然流產(chǎn)之間的關(guān)系時(shí)至今日尚無明確定論。 DNA甲基化水平受DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低、組蛋白甲基化異常、RNA干擾以及飲食環(huán)境因素等方面的影響,并與個(gè)體的年齡相關(guān)。DNA甲基化必須在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下才能完成,因此,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶酶對DNA甲基化作用至關(guān)重要。目前已發(fā)現(xiàn)有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有Dnmtl、 Dnmt3a和Dnmt3b。其中Dnmtl是哺乳動物最主要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,表達(dá)于復(fù)制狀態(tài)的增殖細(xì)胞,能夠優(yōu)先催化復(fù)制后半甲基化的DNA雙鏈,使低甲基化的子鏈完全甲基化,確保每個(gè)細(xì)胞的DNA甲基化模式的正常復(fù)制,在甲基化的維持中具有重要作用。Dnmt3a和Dnmt3b是重新甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,其主要功能是特異性地作用于未甲基化的DNA雙鏈,在配子形成期和胚胎早期重新建立甲基化模式,且兩者在催化功能上相互補(bǔ)充,Dnmt3a可優(yōu)先使核小體之外裸露部分的DNA甲基化,而Dnmt3b則可使核心區(qū)DNA甲基化。目前,國內(nèi)外關(guān)于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與甲基化水平的相關(guān)性的報(bào)告很多,但結(jié)果卻不盡相同。Li-Jun Y、 Liu Q、 Robert和Suzuki的研究結(jié)果表明,Dnmtl在DNA甲基化過程發(fā)揮著主導(dǎo)作用；Rheel和Leu的結(jié)果表明,在DNA甲基化過程中,Dnmtl和Dnmt3b是聯(lián)合起作用的；而Ting的兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明,不同細(xì)胞對Dnmtl的依賴性不同,即Dnmtl在某些細(xì)胞甲基化過程中并不起主導(dǎo)作用。另外,關(guān)于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶對自然流產(chǎn)中DNA甲基化作用的研究論文只有一篇,即Li-Jun Y等在2012年對自然流產(chǎn)絨毛DNA甲基化水平與Dnmtl、 Dnmt3a蛋白表達(dá)關(guān)系的研究。結(jié)果顯示：與人工流產(chǎn)絨毛相比,自然流產(chǎn)絨毛中存在DNA甲基化水平降低的現(xiàn)象,同時(shí)Dnmtl蛋白表達(dá)不足,提示Dnmtl不足和自然流產(chǎn)絨毛組織中DNA甲基化水平的降低可能存在相關(guān)性。由于相關(guān)研究報(bào)道數(shù)量太少,所以,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在自然流產(chǎn)絨毛中DNA甲基化的促進(jìn)和維持過程中到底發(fā)揮著什么樣的作用,他們之間的關(guān)系究竟為何?這些問題仍有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來回答。 基于以上分析,本研究旨在于探討DNA甲基化水平與不明原因早期自然流產(chǎn)的相關(guān)性,以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、 Dnmt3a和Dnmt3b在早期自然流產(chǎn)絨毛DNA甲基化的促進(jìn)和維持中的作用。本實(shí)驗(yàn)分為以下三部分： 第一部分：高效液相法檢測基因組DNA甲基化水平方法的建立。采用的色譜條件：Agilent1100高效液相色譜儀(Agilnt G1311A泵、Agilnt G1316A紫外檢測器、AgilntG1313A自動進(jìn)樣器),Thermo C18柱(6mm×250mm,5μm),0.1%甲酸溶液-甲醇(體積比99：1)為流動相；流速1ml/min,進(jìn)樣量20μl,紫外檢測波長280nim,柱溫30℃。 (1)紫外吸收波長的優(yōu)化。用兩標(biāo)準(zhǔn)品混合液在240-300nm之間進(jìn)行波長掃瞄,選擇最佳的紫外吸收波長。 (2)標(biāo)準(zhǔn)方程的建立。配制的5管不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液,其中脫氧胞苷(dc)的濃度分別為1、5、10、50、10Oμmol/L;5-甲基脫氧胞苷(5-dmc)的濃度分別為0.05、0.25、0.5、2.5、5μmol/L.分別進(jìn)樣,利用峰面積對相應(yīng)的物質(zhì)量濃度(μmol/L)繪制dC和5-dmC的標(biāo)準(zhǔn)方程。 (3)精密度實(shí)驗(yàn)。使用5號管兩標(biāo)準(zhǔn)品混合液連續(xù)進(jìn)樣5次,利用峰面積和保留時(shí)間計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),以反映儀器的精密度。 (4)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。每小時(shí)進(jìn)樣一次5號管兩標(biāo)準(zhǔn)品混合液,連續(xù)5次,利用峰面積和保留時(shí)間計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差及RSD,以反映樣品和儀器的穩(wěn)定性。 (5)專屬性實(shí)驗(yàn)。用純水分別代替酶解后樣品和DNA溶液作為空白對照和陰性對照,將標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品、空白對照品和陰性對照品逐個(gè)進(jìn)樣,比較峰形和保留時(shí)間以判斷該方法對檢測dc和5-dmmc的專屬性。 第二部分：基因組DNA甲基化水平與不明原因早期自然流產(chǎn)相關(guān)性的研究。本部分實(shí)驗(yàn)分為自然流產(chǎn)母親組、自然流產(chǎn)絨毛組、人工流產(chǎn)母親組和人工流產(chǎn)絨毛組。采用第一部分建立的高效液相色譜法測得每個(gè)樣品dC和5-dmC的峰面積,以求得每組5-dmC/(dC+5-dmC)平均比值,并以此代表總體DNA甲基化水平。 DNA甲基化水平(%)=5-dmC/(5-dmC+dC)×100% 第三部分：從mRNA表達(dá)量上研究Dnmt1、 Dnmt3a和Dnmt3b在早期自然流產(chǎn)絨毛基因組DNA甲基化中的作用。本部分實(shí)驗(yàn)分為自然流產(chǎn)絨毛組和人工流產(chǎn)絨毛組。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法((RT-PCR)分別比較各組絨毛組織中Dnmt1、 Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表達(dá)。 結(jié)果 第一部分：高效液相法檢測基因組DNA甲基化水平的建立 (1)紫外吸收波長的確定 dc和5-dmmc兩標(biāo)準(zhǔn)品混合液在240-300nim之間進(jìn)行波長掃瞄的結(jié)果顯示：dC在280-295nm間的吸光度相差不大,5-dmC在280nm處有最大吸收,最后選用280nim為紫外吸收波長。 (2)標(biāo)準(zhǔn)方程的建立 利用峰面積相對應(yīng)的物質(zhì)量濃度繪制dC和5-dmC的標(biāo)準(zhǔn)方程。dc的標(biāo)準(zhǔn)方程為：=0.17X+0.0004,r=0.999：5-dmC的標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=0.18X+1.711,r=1。說明它們的摩爾濃度和峰面積之間呈良好的線性關(guān)系。 (3)精密度實(shí)驗(yàn) dC的保留時(shí)間為5.98±0.09,RSD=1.5%；峰面積為5540.3±59.13,RSD=1.1%。5-dmC的保留時(shí)間為11.38±0.17,RSD=1.5%；峰面積為259.2±3.38,RSD=1.3%。表明儀器的精密度良好。 (4)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) dC的保留時(shí)間為5.94±0.83,RSD=1.3%：峰面積為5536.1±61.43,RSD=1.1%；5-dmC的保留時(shí)間為11.45±0.11,RSD=0.9%;峰面積為258.06±2.33,RSD=0.9%。表明樣品和儀器的穩(wěn)定性良好。 (5)專屬性實(shí)驗(yàn) 空白對照、陰性對照和待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的峰型相比較,空白對照和陰性對照的圖譜中均無目標(biāo)峰型出現(xiàn)；檢測待測樣品時(shí),色譜圖中雖然出現(xiàn)了目標(biāo)峰和其他雜峰,但雜峰對目標(biāo)峰沒有造成干擾。表明專屬性良好。 第二部分：基因組DNA甲基化水平與早期自然流產(chǎn)相關(guān)性的研究 (1)自然流產(chǎn)母親組和人工流產(chǎn)母親組年齡的比較 34個(gè)自然流產(chǎn)婦女年齡為21-43歲,平均30.85±5.28(歲)；33例人工流產(chǎn)婦女年齡為23～48(歲),平均29.52±4.95(歲)。兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.289)。 (2)自然流產(chǎn)母親組和人工流產(chǎn)母親組基因組DNA甲基化水平的比較 34例自然流產(chǎn)母親組DNA甲基化水平為4.41±0.65；33例人工流產(chǎn)母親組DNA甲基化水平4.15±0.63。兩組間DNA甲基化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.103)。 (3)自然流產(chǎn)絨毛組和人工流產(chǎn)絨毛組基因組DNA甲基化水平的比較 45例自然流產(chǎn)絨毛組DNA甲基化水平為2.29±0.37；44例人工流產(chǎn)絨毛組DNA甲基化水平為4.56±1.02。兩組間DNA甲基化水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 第三部分：從mRNA表達(dá)量上研究Dnmtl、 Dnmt3a和Dnmt3b 在自然流產(chǎn)絨毛基因組DNA甲基化中的作用 (1)自然流產(chǎn)絨毛組與人工流產(chǎn)絨毛組Dnmtl mRNA表達(dá)量的比較 30例自然流產(chǎn)絨毛組織Dnmtl mRNA的相對表達(dá)量為0.033±0.007；33例人工流產(chǎn)絨毛組織Dnmtl mRNA的相對表達(dá)量為0.071±0.017。兩組間Dnmtl mRNA的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 (2)自然流產(chǎn)絨毛組與人工流產(chǎn)絨毛組Dnmt3a mRNA表達(dá)量的比較 30例自然流產(chǎn)絨毛組織Dnmt3a mlhNA的相對表達(dá)量為0.072±0.013；33例流產(chǎn)人工絨毛組織Dnmt3a mRNA的相對表達(dá)量為0.184±0.049。兩組間Dnmt3a mRNA的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 (3)自然流產(chǎn)絨毛組與人工流產(chǎn)絨毛組Dnmt3b mRNA表達(dá)量的比較 30例自然流產(chǎn)絨毛組織Dnmt3b mRNA的相對表達(dá)量為0.008±0.003；33例人工自然流產(chǎn)絨毛組織Dnmt3b mRNA的相對表達(dá)量為0.005±0.001。兩組間Dnmt3b mRNA的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.071)。 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究可得出以下初步結(jié)論： (1)本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測全基因組DNA甲基化水平,儀器精密度及穩(wěn)定性良好,該方法對檢測dc和5-dmc專屬性強(qiáng)； (2)自然流產(chǎn)絨毛中確實(shí)存在著基因組DNA甲基化水平降低的現(xiàn)象,絨毛基因組DNA甲基化水平降低很可能是自然流產(chǎn)的一種獨(dú)立誘發(fā)因素； (3)自然流產(chǎn)絨毛組織中基因組DNA甲基化水平降低的現(xiàn)象可能是由Dnmt1和Dnmt3a共同作用的結(jié)果；Dnmt3b可能在自然流產(chǎn)絨毛組織中基因組DNA甲基化水平降低中不起主要作用。
[Abstract]:Natural abortion is a common pathological pregnancy . The occurrence rate of spontaneous abortion is 10 - 15 % of the total pregnancy , and more than 80 % of spontaneous abortion occurs in the early pregnancy ( within 12 weeks of pregnancy ) . The cause of spontaneous abortion is complicated , which involves the unknown factors such as inheritance , immunity , endocrine , reproductive tract anatomy , infection , trauma , and even the environment . Under the current inspection and medical technology conditions , there are still up to 60 - 70 % of spontaneous abortion who cannot find the exact cause .

According to the traditional cytogenetics observation ( karyotype analysis ) , there are some chromosomal abnormalities in the spontaneous abortion at about half of the 15 pregnant weeks . The results of this lab show that the chromosome aberration accounts for 55.3 % ( 88 / 165 ) of the early spontaneous abortion , but 46.7 % ( 77 / 165 ) of the karyotype normal can not find the clear cause . Therefore , it is necessary to further explore the cause of spontaneous abortion and its pathogenesis .

DNA methylation is the most important form of DNA methylation . DNA methylation is the most important form of DNA methylation .

However , the study of DNA methylation level is focused on various tumors , such as gastric cancer , colon cancer , etc . There are only 2 studies on the relationship between DNA methylation and spontaneous abortion . The results show that DNA methylation level may be related to spontaneous abortion .

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本文編號：1934308