本文選題：缺氧誘導(dǎo)因子-1a + 脯氨酸羥化酶��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：子宮內(nèi)膜異位癥是臨床常見病、多發(fā)病,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,其雖是良性病變,但有惡性腫瘤的生物學(xué)行為,目前子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。課題組前期研究表明:HIF-1a(缺氧誘導(dǎo)因子-1a)在子宮內(nèi)膜異位癥中表達(dá)升高,證實(shí)子宮內(nèi)膜異位癥存在乏氧狀態(tài)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過對(duì)HIF-1a與惡性腫瘤的生物表達(dá)學(xué)特性之間的關(guān)系研究,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)調(diào)控途徑有VHL腫瘤抑制蛋白途徑、MAPK途徑、PI3K途徑、RACK1途徑。因HIF-1a在子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)增強(qiáng),HIF-1a表明不被降解。而在常氧條件下的調(diào)控途徑是VHL腫瘤抑制蛋白途徑;PHD(脯氨酸羥化酶)是一種氧傳感器,是HIF-1a降解的關(guān)鍵限速酶,研究發(fā)現(xiàn)VHL蛋白能識(shí)別并結(jié)合564位脯氨酸被羥化的HIF-1a,而脯氨酸羥化酶PHD2能特異性羥化HIF-1a氧依賴降解結(jié)構(gòu)中Pro-564,鑒于以上研究,我們分析因子宮內(nèi)膜異位癥存在乏氧狀態(tài),在乏氧條件下,PHD不能被活化,不能從蛋白質(zhì)含量和轉(zhuǎn)錄活性兩個(gè)方面介導(dǎo)HIF-1a,HIF-1a不能被降解;同樣在乏氧條件下,VHL(希佩爾林道抑癌基因)不能識(shí)別HIF-1a亞基致其不被降解而活性增強(qiáng)。那么在子宮內(nèi)膜異位癥中PHD2、VHL如何調(diào)控HIF-1a及相互間的關(guān)系研究尚未見報(bào)道。既然子宮內(nèi)膜異位癥存在乏氧狀態(tài),那么深入研究其乏氧調(diào)控可以進(jìn)一步明確其發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)對(duì)明確內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制有重要意義。目前其缺乏有效的治療,前期的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)腎溫陽化瘀方治療子宮內(nèi)膜異位癥療效確定,那么該方是否通過影響VHL基因蛋白及PHD2羥化酶而起到治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用,其作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。目的:通過臨床研究HIF-1a及其調(diào)控因子PHD2、VHL在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位組織中的表達(dá),探討PHD2、VHL與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的關(guān)系;觀察補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠HIF-1a、PHD2、VHL表達(dá)的影響,研究補(bǔ)腎溫陽化瘀方治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機(jī)制。方法:1 HIF-1a及其調(diào)控因子PHD2、VHL在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組:選取2013年9月至2014年8月在河北省中醫(yī)院、河北省醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、石家莊市六院患子宮內(nèi)膜異位癥而行腹腔鏡或開腹手術(shù)治療的患者20例,術(shù)中留取同一患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜新鮮組織(患者簽署知情同意書),術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)為子宮內(nèi)膜組織。術(shù)前3個(gè)月未用過激素治療,年齡26-39歲,平均34.0±3.77歲。對(duì)照組:收集同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)患者的子宮肌瘤及正常子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照組,且術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為子宮肌瘤及正常子宮內(nèi)膜組織。患者年齡30-40歲,平均年齡:35.1±3.87歲。兩組患者年齡分布均衡,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。采用免疫組織化學(xué)、蛋白免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、子宮肌瘤、正常組織中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白的表達(dá),RT-PCR方法檢測(cè)HIF-1a m RNA、PHD2 m RNA、VHL m RNA的表達(dá)。2腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型的建立模擬婦科“冒雨涉水,感受寒邪”的病因,依據(jù)“寒邪傷陽”的中醫(yī)學(xué)理論,結(jié)合傳統(tǒng)的“自體移植”子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型,以建立病證結(jié)合的“腎陽虛血瘀證”子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型。依據(jù)冷凍時(shí)間長(zhǎng)短及前后順序行3種不同的方法造模,方法如下:冷凍1個(gè)月,行子宮內(nèi)膜異位癥造模,再冷凍1個(gè)月設(shè)為“冷凍+造模+冷凍”組;冷凍1個(gè)月,行子宮內(nèi)膜異位癥造模后不冷凍為“冷凍+造�！苯M;先不冷凍,行子宮內(nèi)膜異位癥造模后,繼續(xù)冷凍1個(gè)月,設(shè)為“造模+冷凍”組,另設(shè)空白對(duì)照組。用大鼠宏觀表現(xiàn)及理化檢驗(yàn)指標(biāo)評(píng)價(jià)該模型的臨床符合度。3補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠HIF-1a、PHD2、VHL表達(dá)的影響將50只SD大鼠分為空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)、假手術(shù)組、模型組、中藥組、西藥組,每組10只。其中對(duì)照組、假手術(shù)組常規(guī)飼養(yǎng),模型組、中藥組、西藥組采用“延長(zhǎng)冰箱冷凍加冰水浸泡”30天,再結(jié)合“自體移植法”創(chuàng)建內(nèi)異癥腎陽虛血瘀證模型,術(shù)后給予中藥組補(bǔ)腎溫陽化瘀方、西藥組孕三烯酮灌胃,模型組、對(duì)照組、假手術(shù)組灌服等體積的生理鹽水,造模4周后觀察大鼠異位灶大小及形態(tài),HE染色光鏡觀察子宮在位內(nèi)膜及異位組織形態(tài)學(xué)的變化,免疫組化SABC法、Western blotting檢測(cè)HIF-1a、PHD2、VHL蛋白,RT-PCR方法檢測(cè)HIF-1a m RNA、PHD2m RNA、VHL m RNA表達(dá)。結(jié)果:1 HIF-1a、PHD2、VHL在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)1.1免疫組化法檢測(cè)異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、子宮肌瘤、正常子宮內(nèi)膜組織中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白的表達(dá)結(jié)果1.1.1 HIF-1a的表達(dá)HIF-1a的陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒狀,在異位組織中細(xì)胞排列紊亂,上皮細(xì)胞染色淺,腺體上皮細(xì)胞變薄;在位組腺體相對(duì)清晰,陽性細(xì)胞染色較深,子宮肌瘤組織中細(xì)胞排列紊亂,無完整腺體,結(jié)構(gòu)模糊,細(xì)胞收縮、壞死,陽性細(xì)胞表達(dá)淺。在正常子宮內(nèi)膜組腺體完整,陽性細(xì)胞染色淺。以平均光密度值表達(dá),值越大表明含量越高。HIF-1a在各組表達(dá)由高到低的順序:異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、正常子宮內(nèi)膜組。異位內(nèi)膜HIF-1a的表達(dá)增強(qiáng),與子宮肌瘤、在位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在位內(nèi)膜組與子宮肌瘤、正常內(nèi)膜組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),子宮肌瘤組與正常內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.1.2 PHD2的表達(dá)PHD2的陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。異位內(nèi)膜組腺體完整,陽性細(xì)胞表達(dá)淺;在位內(nèi)膜組腺體完整,上皮細(xì)胞薄,陽性細(xì)胞表達(dá)淺;子宮肌瘤組無完整腺體,陽性細(xì)胞表達(dá)深;正常內(nèi)膜組:腺體完整,細(xì)胞排列緊密,陽性細(xì)胞染色深。PHD2在各組表達(dá)由高到低的順序是:正常內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組。PHD2在正常內(nèi)膜組的表達(dá)與子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);子宮肌瘤組與在位、異位內(nèi)膜組表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組表達(dá)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.1.3 VHL的表達(dá)VHL陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。異位內(nèi)膜組表現(xiàn)為腺體不完整,陽性細(xì)胞染色淺;在位內(nèi)膜組:腺體較完整,細(xì)胞染色淺;子宮肌瘤組:腺體不完整,上皮細(xì)胞薄,呈扁平狀,陽性細(xì)胞染色較深;正常內(nèi)膜組:腺體完整,上皮細(xì)胞呈柱狀,結(jié)締組織中有少量表達(dá),陽性細(xì)胞在游離端表達(dá)最深。VHL在各組表達(dá)由高到低的順序是:正常子宮內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組。VHL在正常子宮內(nèi)膜組的表達(dá)與子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);子宮肌瘤組與在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2 Western-blot檢測(cè)異位、在位內(nèi)膜、子宮肌瘤、正常內(nèi)膜組織中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白的表達(dá)結(jié)果1.2.1 HIF-1a蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示:HIF-1a蛋白在各組表達(dá)由高到低的順序是:異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、正常內(nèi)膜組。異位內(nèi)膜組與在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、正常內(nèi)膜組的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在位內(nèi)膜組與子宮肌瘤組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與正常內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);子宮肌瘤組與正常內(nèi)膜組比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2.2 PHD2蛋白的表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:PHD2蛋白在各組表達(dá)由高到低的順序是:正常內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組。正常內(nèi)膜組與異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與子宮肌瘤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);子宮肌瘤組與在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在位內(nèi)膜組與異位內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2.3 VHL蛋白的表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:VHL蛋白在各組表達(dá)由高到低的順序是:正常內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組。正常內(nèi)膜組與異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);子宮肌瘤組與異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.3 RT-PCR檢測(cè)在位內(nèi)膜和異位灶組織HIF-1a mRNA、PHD2 mRNA、VHL m RNA表達(dá)1.3.1 HIF-1a m RNA的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示:HIF-1a m RNA在各組表達(dá)由高到低的順序是:異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、正常內(nèi)膜組。異位內(nèi)膜組HIF-1a的表達(dá)增強(qiáng),與在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、正常內(nèi)膜組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在位內(nèi)膜組與子宮肌瘤組、正常內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),子宮肌瘤組與正常子宮內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.3.2 PHD2 mRNA的表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:異位內(nèi)膜組PHD2 m RNA的表達(dá)由高到低的順序是:正常內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組。異位內(nèi)膜組與正常內(nèi)膜組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在位內(nèi)膜組與正常內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與子宮肌瘤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);子宮肌瘤組與正常內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.3.3 VHL m RNA的表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:異位內(nèi)膜組VHL mRNA的表達(dá)由高到低的順序是:正常內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組。異位內(nèi)膜組與在位內(nèi)膜組、子宮肌瘤組、正常內(nèi)膜組比較,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在位內(nèi)膜組與子宮肌瘤組及正常內(nèi)膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),子宮肌瘤組與正常內(nèi)膜組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.4 HIF-1a與PHD2、VHL表達(dá)的相關(guān)性結(jié)果顯示:HIF-1a與PHD2呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.908;HIF-1a與VHL呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.875。2腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型的建立2.1大鼠一般情況實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)照組大鼠的毛色白且有光澤、精神佳、活潑、反應(yīng)靈敏,飲食、二便均正常。冷造冷組、冷造、造冷組大鼠出現(xiàn)身臟毛污,反應(yīng)遲鈍,蜷縮懶動(dòng),后肢行動(dòng)遲緩、寒戰(zhàn),扎堆怕冷、爪尾部蒼白,尾部皮下瘀紫、耳色蒼白,呼吸微弱,被毛無光澤,飲水量少,大便稀溏等。冷造冷組大鼠表現(xiàn)更為明顯。2.2盆腔異位灶觀察肉眼見冷造冷組移植物生長(zhǎng)良好,體積明顯增大,呈隆起暗紅色或透亮的小囊狀,內(nèi)部充滿積液,表面血管清晰可見,異位組織周圍血管豐富,有些異位組織與周圍組織粘連;冷造及造冷組移植物體積較小,表面血管細(xì),異位組織周圍血流差。2.3各組大鼠體溫情況冷凍1個(gè)月后,冷造冷組、冷造組大鼠體溫較造冷組及對(duì)照組大鼠體溫降低,統(tǒng)計(jì)處理后,冷造冷組大鼠體溫與造冷組、對(duì)照組大鼠比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與冷造組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),造冷組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。冷凍2個(gè)月后,冷造冷組與冷造組、空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),冷造冷組與造冷組大鼠體溫比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),冷造組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.4各組大鼠體重情況冷凍1個(gè)月后,各組大鼠體重有所增加,但冷造冷組、冷造組較造冷組、對(duì)照組比較體重上升緩慢,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后,冷造冷組與造冷組、對(duì)照組比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與冷造組比較其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。造冷組與冷造組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),造冷組與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);冷凍2個(gè)月后,冷造冷組與造冷組、冷造組、對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),造冷組與冷造組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.5各組大鼠血清性激素水平比較各組大鼠的雌二醇、孕酮、睪酮水平由低到高的順序是:冷造冷組、造冷組、冷造組、空白對(duì)照組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,冷造冷組雌二醇水平與其余各組比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),造冷組、冷造組比較其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),冷造冷組、造冷組、冷造組、空白對(duì)照組間睪酮、孕酮水平兩兩比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.6各組大鼠血流變?nèi)扯取⑦�原粘度的比較結(jié)果顯示:各組大鼠全血粘度由高到低的順序是:冷造冷組、造冷組、冷造組、對(duì)照組。全血粘度的低切、中切、高切比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后,冷造冷組、造冷組、冷造組、對(duì)照組大鼠全血粘度的低切、中切及高切間兩兩比較后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各組間還原粘度由高到低的順序是:冷造冷組、造冷組、冷造組、對(duì)照組。還原低切兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);冷造冷組與造冷組、空白對(duì)照組中切比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),冷造冷組與冷造組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);冷造冷組與冷造組、對(duì)照組高切比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與造冷組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),造冷組與冷造組、對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.7大鼠臟器指數(shù)的比較各組大鼠的脾臟指數(shù)由低到高的順序是冷造冷組、造冷組、冷造組、對(duì)照組。冷造冷組與造冷組、冷造組、對(duì)照組比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),造冷組與對(duì)照組比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與冷造組比較其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),冷造組、對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);冷造冷組大鼠胸腺指數(shù)低到高的順序是冷造冷組、造冷組、冷造組、對(duì)照組。冷造冷組與造冷組、冷造組、空白對(duì)照組比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),造冷組、冷造組、空白對(duì)照組兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);大鼠的子宮指數(shù)由低到高的順序是冷造冷組、造冷組、冷造組、對(duì)照組。冷造冷組與造冷組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),冷造冷組與冷造組、空白對(duì)照組其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),冷造組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.8各組大鼠血清CA125、c AMP、c GMP的影響結(jié)果顯示,冷造冷組大鼠血清CA125、c GMP表達(dá)高于造冷組、冷造組、對(duì)照組,與各組比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);造冷組表達(dá)高于冷造組、對(duì)照組,與冷造組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),冷造組的表達(dá)高于對(duì)照組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);冷造冷組大鼠血清c AMP表達(dá)低于其余各組,與其余各組比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),冷造組、造冷組大鼠c AMP的表達(dá)均低于對(duì)照組,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),造冷組的表達(dá)高于冷造組,與其比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠HIF-1a、PHD2、VHL表達(dá)的影響3.1大鼠一般情況對(duì)照組大鼠毛色白有光澤,精神佳,活潑,喜動(dòng),反應(yīng)靈敏,飲食大便正常。假手術(shù)組大鼠較對(duì)照組大鼠毛色稍暗,精神可,較活潑,喜動(dòng),反應(yīng)較靈敏,飲食大便正常。模型組大鼠身臟毛污,反應(yīng)遲鈍,蜷縮懶動(dòng),飲食量少,大便稀溏。中藥組、西藥組大鼠表現(xiàn)為身臟毛色較暗,反應(yīng)較靈敏,活動(dòng)可,飲食量稍少,大便成形。3.2異位灶形態(tài)學(xué)觀察中藥組、西藥組、模型組均見移植物生長(zhǎng)良好,體積明顯增大,呈隆起暗紅色或透亮的小囊狀,內(nèi)部充滿積液,表面血管清晰可見,異位組織周圍血管豐富,有些異位組織與腹腔臟器粘連。3.3 HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示,對(duì)照組子宮內(nèi)膜規(guī)整,中膜內(nèi)有腺腔、完整、排列整齊,細(xì)胞排列齊整;假手術(shù)組子宮內(nèi)膜較對(duì)照組稍增厚,中膜內(nèi)有腺腔,細(xì)胞排列紊亂;模型組內(nèi)膜較假手術(shù)組內(nèi)膜更厚,腺體不明顯,管腔消失,細(xì)胞排列紊亂,炎性細(xì)胞增多,中藥組管腔完整,但形態(tài)不規(guī)則,內(nèi)膜排列整齊,中膜細(xì)胞排列不整齊;西藥組子宮內(nèi)膜不完整,腺腔不規(guī)則,中膜細(xì)胞收縮,細(xì)胞排列不整齊。3.4 SABC法檢測(cè)子宮在位內(nèi)膜、異位組織中PHD2、VHL、HIF-1a蛋白表達(dá)結(jié)果結(jié)果顯示,HIF-1a陽性顆粒呈棕黃色,主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜、中膜、腺腔細(xì)胞核及胞漿中;PHD2主要表達(dá)在細(xì)胞膜上,胞漿少量表達(dá);VHL陽性染色主要位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿中。平均光密度反映指標(biāo)的含量,值越大,反映指標(biāo)的含量越高。結(jié)果顯示,HIF-1a在各組表達(dá)由高到低的順序是模型組、西藥組、中藥組、假手術(shù)組、對(duì)照組。模型組大鼠HIF-1a表達(dá)均高于對(duì)照組、假手術(shù)組(P0.05);中藥組、西藥組HIF-1a的表達(dá)均低于模型組(P0.05);PHD2、VHL在各組表達(dá)由高到低的順序是對(duì)照組、假手術(shù)組、中藥組、西藥組、模型組。模型組PHD2、VHL的表達(dá)低于對(duì)照組、假手術(shù)組(P0.05),中藥組、西藥組表達(dá)均高于模型組,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.5 Western blotting法檢測(cè)子宮及異位灶組織中HIF-1a、PHD2、VHL蛋白表達(dá)結(jié)果結(jié)果顯示,HIF-1a在各組表達(dá)由高到低的順序是模型組、西藥組、中藥組、假手術(shù)組、對(duì)照組。模型組大鼠HIF-1a的表達(dá)高于對(duì)照組、假手術(shù)組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);HIF-1a在中藥組、西藥組的表達(dá)均低于模型組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),中藥組、西藥組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);PHD2在各組表達(dá)由高到低的順序是對(duì)照組、假手術(shù)組、西藥組、中藥組、模型組。模型組PHD2的表達(dá)低于對(duì)照組、假手術(shù)組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。中藥組、西藥組PHD2的表達(dá)較模型組增加,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),西藥組的表達(dá)高于中藥組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);VHL在各組表達(dá)由高到低的順序是:對(duì)照組、中藥組、西藥組、假手術(shù)組、模型組。模型組VHL的表達(dá)低于對(duì)照組、假手術(shù)組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);中藥組、西藥組VHL的表達(dá)高于模型組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),中藥組、西藥組間比較其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.6各組大鼠子宮在位內(nèi)膜和異位灶組織中HIF-1a m RNA、PHD2 m RNA、VHL m RNA的表達(dá)結(jié)果顯示,HIF-1a m RNA在各組表達(dá)由高到低的順序是模型組、中藥組、西藥組、假手術(shù)組、對(duì)照組。模型組大鼠HIF-1a m RNA的表達(dá)高于對(duì)照組、假手術(shù)組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),對(duì)照組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。模型組表達(dá)高于中藥組、西藥組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),中藥組、西藥組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);PHD2 m RNA在各組表達(dá)由高到低的順序是對(duì)照組、假手術(shù)組、西藥組、中藥組、模型組。模型組大鼠PHD2 m RNA表達(dá)較對(duì)照組、假手術(shù)組低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)對(duì)照組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);模型組表達(dá)低于中藥組、西藥組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),中藥組、西藥組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。VHL m RNA在各組表達(dá)由高到低的順序是對(duì)照組、假手術(shù)組、西藥組、中藥組、模型組。模型組大鼠VHL m RNA表達(dá)低于對(duì)照組、假手術(shù)組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組表達(dá)較中藥組、西藥組低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),中藥組、西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.7 HIF-1a與PHD2、VHL表達(dá)的相關(guān)性結(jié)果表明,HIF-1a與PHD2呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)-0.799,p=0.00),HIF-1a與VHL呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)-0.625,p=0.003)。結(jié)論:1臨床研究表明,HIF-1a在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位組織中表達(dá)增強(qiáng),PHD2、VHL蛋白在子宮異位內(nèi)膜組織中表達(dá)降低,證實(shí)子宮內(nèi)膜異位癥存在乏氧狀態(tài)。通過相關(guān)性研究表明,HIF-1a與PHD2、VHL均呈負(fù)相關(guān),表明在乏氧條件下,PHD2不被活化,VHL不能識(shí)別HIF-1a亞基,致HIF-1a的表達(dá)增強(qiáng),提示HIF-1a、PHD2、VHL在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程中起重要作用。2從大鼠的一般情況、盆腔異位病灶觀察、血清孕酮、睪酮、雌二醇、血流變等指標(biāo)及大鼠體溫、體重等情況進(jìn)行評(píng)估,“冷凍1個(gè)月-行子宮內(nèi)膜異位癥造模-再冷凍1個(gè)月”的“冷造冷組”實(shí)驗(yàn)大鼠模型最符合腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥臨床特征�？勺鳛槟I陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥的動(dòng)物模型。3補(bǔ)腎溫陽化瘀方可以降低腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位灶中HIF-1a的表達(dá),改善子宮內(nèi)膜異位癥的乏氧狀態(tài),使脯氨酸羥化酶PHD2的活性增強(qiáng),進(jìn)一步介導(dǎo)HIF-1a的降解;同時(shí)VHL與HIF-1a亞基結(jié)合而使后者蛋白化而被降解,從而使HIF-1a的表達(dá)降低,PHD2、VHL的表達(dá)升高,起到治療腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R711.71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1933079