本文選題：BPA + F2代�。� 參考：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：在機體早期發(fā)育的過程中暴露于雙酚A可導(dǎo)致機體發(fā)育關(guān)鍵器官和組織發(fā)生表觀遺傳特征的改變,并導(dǎo)致成年階段的能量代謝穩(wěn)態(tài)的破壞,產(chǎn)生胰島素抵抗、糖耐量受損等2型糖尿病特征。如果FO代的母體在懷孕和哺乳階段受到了雙酚A的直接暴露,則其F1代的原始生殖細胞同樣處于BPA的直接暴露之下,并由此導(dǎo)致F1代生殖細胞表觀遺傳信息的改變,這種改變可以通過生殖細胞再傳遞給F2代個體。雙酚A可以通過改變原始生殖細胞的表觀遺傳信息,從而導(dǎo)致隔代的毒理效應(yīng),這種推理存在理論上的可能。因此,F0代母體在圍產(chǎn)期暴露于雙酚A是否會使得F2代個體與F1代一樣,產(chǎn)生能量代謝紊亂的癥狀,是一個不可回避的問題。在本研究中,F0代SD大鼠在懷孕和哺乳期間通過灌胃的方式每天給予40μg/kg/day的BPA暴露,而隨后的與F1代雄鼠交配的雌鼠和F2代大鼠均不再受到BPA的直接暴露。我們通過葡糖糖耐量實驗(ipGTT)和胰島素耐量(ipITT)實驗,以及瘦素脂聯(lián)素等血生化指標來反映F2代的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素抵抗水平,并通過發(fā)現(xiàn)胰島素通路關(guān)鍵基因的表達改變來進一步證實胰島素抵抗和糖耐量損傷的狀態(tài)。同時,我們繼續(xù)在F2代的肝臟和F1代的生殖細胞中尋找可能的表觀遺傳靶點。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對于對照組雙酚A暴露組的F2代大鼠,其葡萄糖耐量誰和胰島素耐量水平均出現(xiàn)了明顯下降,同時肝臟葡萄糖激酶(GCK)的基因相對表達水平也顯著下調(diào)。甲基化測序結(jié)果顯示,GCK啟動子區(qū)域的12個甲基化位點在BPA暴露組的F2代肝臟組織為全部為甲基化的狀態(tài),而在對照組F2代大鼠中則有5個位點為非甲基化的狀態(tài)。在F1的精子中,僅CpG位點-314中在BPA暴露組和對照組之間呈現(xiàn)不同的甲基化狀態(tài)。而無論是F2代肝臟還是F1代雄性大鼠的精子,BPA暴露組均出現(xiàn)了明顯地全基因組低甲基化現(xiàn)象。同時,BPA暴露所導(dǎo)致的F2代胰島素抵抗和糖耐量異常,F2代肝臟Gck基因甲基化模式的改變,以及F1代精子Gck基因甲基化模式的改變,與F1代能量代謝紊亂癥狀和F1代神經(jīng)行為發(fā)育異常之間沒有顯著地相關(guān)性。提示F2代所產(chǎn)生的現(xiàn)象時由F0代母鼠圍產(chǎn)期暴露于BPA所直接導(dǎo)致的。 本研究的結(jié)論是,FO代妊娠和哺乳期BPA暴露可引起F2代的胰島素抵抗和糖耐量受損通,而DNA甲基化的改變是主要的作用機制。然而F1代的精子中所攜帶的BPA暴露導(dǎo)致隔代能量代謝紊亂的表觀遺傳信息靶點有待進一步地闡明。 第一部分：F0代圍產(chǎn)期BPA暴露對F2代糖耐量和胰島素抵抗的影響 目的：研究FO代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露對F2代糖耐量和胰島素抵抗的影響。 方法：將F0代孕鼠隨機分為對照組和BPA暴露組,從受孕第0天開始分別進行玉米油和BPA (40μg/kg body weight/day)灌胃染毒。F1代雄鼠大鼠成年后與未受到過BPA暴露的成年雌性大鼠交配,以此產(chǎn)生F2代大鼠。F2代大鼠出生后,記錄每窩產(chǎn)仔數(shù),并持續(xù)測量其體重變化和攝食量的變化。F2代大鼠出生后的第9周和第20周,通過胰島素耐量實驗(ipITT)口葡萄糖耐量實驗來評價F2代大鼠的胰島素抵抗情況和糖耐量水平。同時用血糖儀分析F2代大鼠的空腹血糖水平,以及使用采用ELISA法分析空腹胰島素、血液瘦素和脂聯(lián)素水平,并通過血糖和胰島素水平計算F2大鼠胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。同時分析F2代GTT實驗曲線下面積與F1代GTT曲線下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果：F2代大鼠的每窩死亡率也未受到FO代母鼠BPA暴露的影響。F2代各組組間的產(chǎn)仔數(shù)差異、性別比例以及仔鼠出生體重的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。同時與對照組F2代相比,BPA暴露組F2代在生長國產(chǎn)中各個時間點的體重和攝食量上也均無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。BPA暴露組F2代大鼠與對照組F2代大鼠的空腹血糖、瘦素和脂聯(lián)素之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。然而與對照組相比在F2代大鼠出生后第20周,BPA暴露組的空腹胰島素水平明顯升高(p0.05)。通過計算胰島素抵抗指數(shù)發(fā)現(xiàn),BPA暴露組亦有明顯升高(p0.05)。同時,葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗的結(jié)果顯示,BPA暴露組F2代大鼠,其的糖耐量水平和胰島素耐量水平均明顯下降(p0.05)。同時F2代GTT實驗曲線下面積與F1代GTT曲線下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間不具有關(guān)聯(lián)性。 結(jié)論：F0代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露可以導(dǎo)致F2代糖耐量受損,出現(xiàn)胰島素抵抗的癥狀。 第二部分：F0代圍產(chǎn)期BPA暴露對F2代能量代謝相關(guān)基因及肝臟Gck基因甲基化的影響 目的：研究FO代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露對F2代大鼠能量代謝相關(guān)基因及肝臟Gck基因甲基化模式的影響。 方法：將F0代孕鼠隨機分為對照組和BPA暴露組,從受孕第0天開始分別進行玉米油和BPA (40μg/kg body weight/day)灌胃染毒。F1代雄鼠大鼠成年后與未受到過BPA暴露的成年雌性大鼠交配,以此產(chǎn)生F2代大鼠。采用熒光定量PCR法檢測Gck, NR4A3, NR4A1, IRS-2and SREBP-1c等基因的相對表達水平。采用western blotting免疫印跡技術(shù)對發(fā)生mRNA表達發(fā)生改變的基因Gck,在其蛋白表達水平進行進一步的驗證。使用總甲基化檢測試劑盒檢測地F2代大鼠肝臟總甲基化的變化,并通過亞硫酸鹽直接測序地方法分析F2代大鼠肝臟Gck基因啟動子區(qū)域甲基化的變化。同時分析F2代肝臟總甲基化與F1代GTT曲線下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果：BPA暴露組F2代大鼠的Gck基因表達水平與對照組相比(0.77±0.05vs1.00±0.06)顯著性升高(p0.05)。而NR4A3, NR4A1, IRS-2and SREBP-1c等胰島素調(diào)控關(guān)鍵基因的相對表達水平在BPA組與對照組之間,沒有顯著地統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。F2代肝臟組織中Gck蛋白的表達水平與對照組相比也有明顯的下降(p0.05)。BPA暴露的F2代大鼠肝臟DNA的總甲基化水平(84.3±0.2%)發(fā)生了顯著性地降低(p0.05)。BPA暴露組的F2代大鼠肝臟中,Gck基因的12個CpG位點全部發(fā)生了甲基化的改變。而在對照組中CpG位點-314、-280、-93、-4和+5均是非甲基化的狀態(tài)。同時,F2代肝臟總甲基化與F1代GTT曲線下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間不具有關(guān)聯(lián)性。 結(jié)論：F0代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露可以導(dǎo)致F2代大鼠Gck基因表達水平下降及肝臟Gck基因甲基化模式的異常改變。 第三部分：F0代圍產(chǎn)期BPA暴露對F1代精子Gck基因甲基化的影響 目的：研究F0代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露對F1代成年大鼠精子Gck基因甲基化模式的影響。 方法：將FO代孕鼠隨機分為對照組和BPA暴露組,從受孕第0天開始分別進行玉米油和BPA (40μ/kg body weight/day)灌胃染毒。F1代雄鼠大鼠成年后與未受到過BPA暴露的成年雌性大鼠交配后,提取其附睪組織并分離出精子。使用總甲基化檢測試劑盒檢測地F1代成年大鼠精子總甲基化的變化,并通過亞硫酸鹽直接測序地方法分析F1代大鼠精子Gck基因啟動子區(qū)域甲基化的變化。采用熒光定量PCR法檢測Gck基因mRNA表達的變化。同時分析F1代精子總甲基化與F1代GTT曲線下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果：與對照組F1代大鼠(95.2±0.3%)相比,BPA暴露組的F1代大鼠精子中的DNA總甲基化水平(90.6±0.20%)也發(fā)生了顯著性地降低(p0.05)。Gck基因的5’端啟動子區(qū)域的12個CpG位點,在BPA暴露組的F1代大鼠精子中全部發(fā)生了甲基化的改變。而在對照組的F1代大鼠精子中CpG位點-314則處于非甲基化的狀態(tài)。然而分析結(jié)果表明,與對照組相比BPA暴露組F1代大鼠精子中的Gck基因表達水平并沒有顯著改變(p0.05)。同時,F1代精子總甲基化與F1代GTT曲線下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間不具有關(guān)聯(lián)性。 結(jié)論：F0代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露可以影響F1代成年大鼠精子總甲基化水平集Gck基因啟動子區(qū)域的甲基化模式。
[Abstract]:In this study , it was found that there was no direct exposure to insulin resistance and impaired glucose tolerance during pregnancy and lactation .

The conclusion of this study is that the exposure of the FO - generation and breast - feeding BPA can lead to impaired insulin resistance and impaired glucose tolerance in the F2 generation , whereas the change in DNA methylation is the primary mechanism of action . However , the apparent genetic information target of the exposure of BPA carried by the F1 - generation sperm to the isolated energy metabolism disorder remains to be further clarified .

Part I : Effect of BPA exposure on F2 generation glucose tolerance and insulin resistance during F0 generation

Objective : To study the effects of BPA exposure on F2 generation glucose tolerance and insulin resistance during pregnancy and lactation in FO - generation dams .

Methods : Female rats were randomly divided into control group and BPA exposure group . Corn oil and BPA ( 40 渭g / kg body weight / day ) were administered from day 0 of conception respectively .

Results : There was no statistical difference ( p . 05 ) between the levels of fasting plasma glucose , leptin and adiponectin in the F2 generation rats . The results showed that the levels of fasting blood glucose , leptin and adiponectin in the F2 generation rats were significantly higher than those in the control group ( p < 0.05 ) .

Conclusion : BPA exposure during pregnancy and lactation in F0 generation can lead to impaired glucose tolerance in F2 generation and the symptoms of insulin resistance .

Part Two : Effects of BPA exposure on the metabolism - related genes and methylation of liver Gck gene in F0 generation

Objective : To study the effects of BPA exposure on energy metabolism - related genes and methylation patterns of liver Gck gene in F2 generation rats during pregnancy and lactation .

Methods : Female rats were randomly divided into control group and BPA exposure group . Corn oil and BPA ( 40 渭g / kg body weight / day ) were administered from day 0 of conception respectively .

Results : Compared with the control group , the expression level of Gck gene was significantly increased ( P < 0.05 ) .

Conclusion : BPA exposure during pregnancy and lactation in F0 rats can lead to the decrease of Gck gene expression in F2 rats and abnormal changes of Gck gene methylation pattern in liver .

The third part : the effect of BPA exposure during F0 generation on methylation of Gck gene in F1 generation

Objective : To study the effect of BPA exposure on the methylation pattern of Gck gene in F1 generation adult rats during pregnancy and lactation .

Methods : Female rats were randomly divided into control group and BPA exposure group . Corn oil and BPA ( 40 渭g / kg body weight / day ) were isolated from day 0 of conception . After mating of F1 generation male rats , the changes of Gck gene promoter region methylation in F1 generation rats were detected by means of total methylation detection kit .

Results : Compared with control group F1 rats ( 90.6 鹵 0 . 3 % ) , the total DNA methylation level ( 90.6 鹵 0.20 % ) of F1 generation rat was significantly lower than that in control group .

Conclusion : BPA exposure during pregnancy and lactation in F0 rats can affect the methylation pattern of Gck gene promoter region in F1 generation adult rat sperm .

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.7

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 嚴衛(wèi)麗;;復(fù)雜疾病全基因組關(guān)聯(lián)研究進展——遺傳統(tǒng)計分析[J];遺傳;2008年05期

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本文編號：1896177