宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一,晚期轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后不良的主要原因。目前認(rèn)為,宮頸癌主要通過(guò)局部侵襲和浸潤(rùn)的方式轉(zhuǎn)移到周圍組織器官及淋巴結(jié)。因此,研究宮頸癌的侵襲機(jī)制對(duì)于改善宮頸癌預(yù)后具有重要的意義。緊密連接蛋白CLDNs表達(dá)異常通過(guò)影響緊密連接結(jié)構(gòu)、功能及相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路,在宮頸癌等上皮來(lái)源腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。CLDN6是CLDNs蛋白家族的27個(gè)成員之一,具有4個(gè)跨膜區(qū),細(xì)胞漿內(nèi)的羧基末端可與AF-6及ZOs等富含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合,參與細(xì)胞對(duì)外界信號(hào)的應(yīng)答和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞過(guò)程。其中AF-6是一種Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)蛋白,與Ras蛋白結(jié)合抑制ERK信號(hào)通路活化。我們前期工作中克隆了候選乳腺癌抑制基因CLDN6,發(fā)現(xiàn)CLDN6明顯抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力;為了研究CLDN6作用機(jī)制,用基因芯片篩查和分析CLDN6靶基因和相關(guān)信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CLDN6抑制ERK信號(hào)通路。本課題組發(fā)現(xiàn),CLDN6在宮頸癌細(xì)胞系中低表達(dá),推測(cè)CLDN6表達(dá)沉默可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。目前關(guān)于宮頸癌細(xì)胞中CLDN6是否抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲表型,CLDN6對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲的影響是否與AF6/ERK信號(hào)通路有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文利用分子生物學(xué)等技術(shù),研究CLDN6對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲的作用及其機(jī)制,為宮頸癌治療及控制早期轉(zhuǎn)移提供新的靶點(diǎn)。方法1.建立過(guò)表達(dá)CLDN6的宮頸癌細(xì)胞穩(wěn)定克隆構(gòu)建p-EGFP-C1/CLDN6真核表達(dá)載體;利用脂質(zhì)體法將CLDN6轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞HELA及C33A,利用G418篩選單細(xì)胞克隆;RT-PCR及Western-blot鑒定CLDN6表達(dá)水平;免疫熒光檢測(cè)CLDN6表達(dá)的定位。2.CLDN6對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲表型的影響(1)跨上皮電阻實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞的單層跨上皮電阻。(2)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞體外遷移侵襲能力。(3)Western-blot和免疫熒光方法檢測(cè)上皮標(biāo)記物E-Cadherin及間質(zhì)標(biāo)記物N-Cadherin和Vimentin的表達(dá)及定位。(4)裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)能力;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)移植瘤組織中E-Cadherin和Ki67的表達(dá)。3.CLDN6抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的作用機(jī)制(1)CLDN6對(duì)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的影響:Western-blot法檢測(cè)ERK及其上游基因MEK1/2及Ras蛋白活化狀態(tài);免疫熒光方法檢測(cè)ERK的表達(dá)及定位。(2)ERK1/2信號(hào)通路激活劑PMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate)對(duì)克隆組細(xì)胞侵襲能力的影響:(1)Western-blot法檢測(cè)PMA作用的最適濃度及最適時(shí)間。(2)Transwell小室法檢測(cè)PMA對(duì)克隆組細(xì)胞侵襲能力的影響;免疫熒光檢測(cè)上皮及間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)及定位。(3)CLDN6通過(guò)AF-6抑制ERK通路及對(duì)細(xì)胞侵襲的作用:(1)免疫熒光方法檢測(cè)克隆組細(xì)胞AF-6蛋白表達(dá)定位;免疫共沉淀方法檢測(cè)CLDN6與AF-6蛋白的結(jié)合狀態(tài)。(2)RNAi技術(shù)沉默AF-6,免疫熒光及Western-blot驗(yàn)證沉默效果;Western-blot及免疫熒光方法檢測(cè)ERK1/2與MEK1/2的活化狀態(tài);Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力;免疫熒光法檢測(cè)上皮及間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)及定位。4.宮頸癌組織中CLDN6、p-ERK與E-Cadherin表達(dá)免疫組化方法檢測(cè)CLDN6、p-ERK與E-Cadherin在56例宮頸癌組織中的表達(dá),并分析p-ERK和E-Cadherin表達(dá)與CLDN6表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果1.建立穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的宮頸癌HELA及C33A細(xì)胞p-EGFP-C1/CLDN6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞HELA和C33A,并用G418篩選14天后,出現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)CLDN6的單細(xì)胞克隆;克隆組CLDN6的m RNA及蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),并主要定位于細(xì)胞膜。2.檢測(cè)過(guò)表達(dá)CLDN6對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲表型的影響過(guò)表達(dá)CLDN6明顯增加單層宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞間跨上皮電阻;降低宮頸癌細(xì)胞的體外侵襲遷移能力;上調(diào)細(xì)胞膜E-Cadherin表達(dá),下調(diào)細(xì)胞質(zhì)N-Cadherin及Vimentin表達(dá);抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)能力,而移植瘤組織中Ki67表達(dá)下調(diào),E-Cadherin表達(dá)上調(diào)。3.CLDN6抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲能力作用機(jī)制(1)CLDN6對(duì)Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的影響:過(guò)表達(dá)CLDN6明顯抑制ERK1/2及其上游基因MEK1/2的磷酸化水平及Ras的活性;ERK1/2由細(xì)胞核移位到細(xì)胞質(zhì)。(2)ERK信號(hào)通路活化對(duì)細(xì)胞侵襲的影響:用100n M PMA處理細(xì)胞4h后,MEK1/2及ERK1/2的磷酸化水平明顯增加;ERK1/2蛋白表達(dá)由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)向細(xì)胞核;細(xì)胞膜上的E-Cadherin表達(dá)下調(diào),細(xì)胞質(zhì)中的Vimentin表達(dá)上調(diào);克隆組細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著增多。(3)CLDN6通過(guò)AF-6影響ERK通路的活化及侵襲作用:(1)空載組細(xì)胞AF-6表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì),克隆組AF-6表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜;克隆組HELA及C33A細(xì)胞中可以檢測(cè)到CLDN6與AF-6的結(jié)合。(2)沉默克隆組細(xì)胞AF-6后,AF-6蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平明顯降低;MEK1/2及ERK1/2的磷酸化水平均明顯升高;細(xì)胞核中ERK蛋白明顯增加,而細(xì)胞膜上的E-Cadherin表達(dá)下調(diào),細(xì)胞質(zhì)中的Vimentin表達(dá)上調(diào);克隆組HELA及C33A細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯增多。4.宮頸癌組織中CLDN6、p-ERK與E-Cadherin表達(dá)56例宮頸癌組織中CLDN6的表達(dá)明顯低于宮頸癌旁組織,并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān);p-ERK在宮頸癌組織中高表達(dá),與宮頸癌分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);p-ERK的表達(dá)與CLDN6呈負(fù)相關(guān);E-Cadherin在宮頸癌組織中低表達(dá),E-Cadherin的表達(dá)與宮頸癌分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);E-Cadherin與CLDN6的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論1.CLDN6可能通過(guò)逆轉(zhuǎn)EMT抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力。2.CLDN6通過(guò)與AF-6結(jié)合,抑制ERK信號(hào)通路的活化可能是CLDN6發(fā)揮作用的機(jī)制之一。3.CLDN6和E-Cadherin的低表達(dá)及p-ERK的高表達(dá)在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展中可能具有一定的作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：1837525