本文選題：hWAPL + c-Myc　； 參考：《鄭州大學》2017年博士論文

【摘要】：宮頸癌(Cervical Cancer)是全球女性第四常見的惡性腫瘤,在女性惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位,每年528,000例婦女被確診為宮頸癌,266,000例婦女死于宮頸癌。而發(fā)展中國家宮頸癌病例占全球總數(shù)的85%。在中國,宮頸癌的發(fā)病率為7.5/10萬,死亡率為3.4/10萬。宮頸癌已成為嚴重威脅婦女生命健康的惡性腫瘤之一。WAPL(wings apart-like)基因是1977年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一個基因,定位于果蠅的X染色體2D5-2D5。在有絲分裂中,WAPL基因編碼的蛋白質(zhì)主要功能是管理異染色質(zhì)結(jié)構(gòu),維持姐妹染色單體的黏合。WAPL基因的變異會妨礙姐妹染色單體的正�？拷筒⒘�,但不影響染色單體各自的凝集和分離。WAPL基因在人體內(nèi)的同源序列稱為h WAPL(human wings apart-like)基因,長約30,793bp,定位于10q23.2。h WAPL蛋白是一種聚合錨定蛋白,和WAPL蛋白保守區(qū)域高度同源。h WAPL蛋白可以在有絲分裂前期使染色體臂的聚合適時解離。但h WAPL基因的過度表達,則會使得姐妹染色單體過早解離。h WAPL基因的高表達會導致細胞染色體斷裂,有絲分裂中產(chǎn)生非整倍體或者多核細胞,導致染色體的不穩(wěn)定性增加,從而擾亂有絲分裂,導致腫瘤發(fā)生。在對多種癌組織及癌細胞系的研究中發(fā)現(xiàn),h WAPL基因僅在宮頸癌組織及細胞系中高表達,是宮頸癌的特異性高表達基因。在對正常宮頸上皮組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)組織和宮頸癌組織的研究中發(fā)現(xiàn),隨著宮頸病變的進展,h WAPL基因的表達逐步增強。h WAPL基因在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。h WAPL基因具有癌基因特性,h WAPL基因表達產(chǎn)物可能起S期檢測點或者其他凋亡路徑的作用。在宮頸癌細胞系中抑制了h WAPL基因的表達會導致細胞凋亡,而在動物實驗中抑制了h WAPL基因的表達則會明顯抑制腫瘤生長。同時hWAPL基因的多態(tài)性和宮頸癌易感性密切相關(guān)。Myc基因是癌基因,c-Myc是其家族的成員之一。人類c-Myc基因定位于染色體8q24區(qū)。c-Myc基因編碼的蛋白質(zhì)是一種具有DNA結(jié)合功能的核蛋白,在核內(nèi)信息傳遞中起重要的作用。c-Myc蛋白在細胞胞漿內(nèi)合成后,轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi),與特異的DNA序列的CACGTG核心序列序列結(jié)合,激活或增強靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達,促進細胞的增殖,同時也參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。c-Myc基因的功能包括,抑制細胞分化,促進細胞增殖,調(diào)節(jié)細胞周期,參與細胞調(diào)亡等。其表達產(chǎn)物是細胞周期由G0/G1向S期演進所必需的,它主要是通過影響各種細胞周期素啟動細胞周期演進。在生理狀況下,c-Myc基因的適度表達維持細胞的正常增殖和凋亡狀態(tài),維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。c-Myc原癌基因如果被激活為癌基因,會使細胞脫離正常生長調(diào)節(jié)的限制并向惡性表型轉(zhuǎn)化,并抑制細胞調(diào)亡。在正常細胞中,c-Myc的表達受到嚴密而且精細的調(diào)控,呈較低的水平表達。c-Myc基因與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在宮頸癌組織中,c-Myc基因的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織。c-Myc基因的擴增和過度表達可能是宮頸癌發(fā)生中的早發(fā)事件。c-Myc基因表達程度隨著宮頸病變的惡性程度增高而增強,而且宮頸癌組織及CIN3組織與CIN1組織及CIN2組織相比,c-Myc基因的表達明顯增強。c-Myc基因表達程度,隨著FIGO分期、病理學分級以及分化程度的升高而升高。c-Myc基因的表達可作為判斷宮頸癌預后的一個重要指標。作為一個只在宮頸癌組織中特異性高表達的癌基因,h WAPL基因在宮頸癌的早期診斷、基因診斷和生物學治療方面具有極其重要的意義。但h WAPL基因的調(diào)控機制、調(diào)控途徑及其在宮頸癌中特異性高表達的原因并不清楚。h WAPL基因核心啟動子定位、轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導途徑等方面,國內(nèi)外都無相關(guān)研究。本課題從h WAPL基因的調(diào)控機制入手,首先研究并明確h WAPL基因核心啟動子的定位;而后根據(jù)h WAPL基因啟動子所在區(qū)域,利用生物信息學方法對h WAPL基因轉(zhuǎn)錄因子進行預測。根據(jù)預測結(jié)果,選擇c-Myc蛋白為研究對象,明確c-Myc蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性;最后研究c-Myc蛋白是否能和h WAPL基因核心啟動子所在區(qū)域結(jié)合,是否是h WAPL基因的轉(zhuǎn)錄因子。實驗目的:1.研究并明確h WAPL基因核心啟動子定位。2.研究c-Myc蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性;3.研究c-Myc蛋白能否和h WAPL基因核心啟動子所在區(qū)域結(jié)合,是否是h WAPL基因的轉(zhuǎn)錄因子。本實驗研究內(nèi)容共分三個部分:第一部分h WAPL基因核心啟動子的定位目的研究并明確h WAPL基因核心啟動子定位。方法應用熒光素酶檢測實驗。1)選取h WAPL上游-3000bp為研究對象,利用熒光素酶檢測為研究方法進行分析將h WAPL上游-3000bp分成兩段,分別是-2617—-1317bp和-1317—-1bp。2)分析步驟如下:構(gòu)建載體,兩段目的基因分別與p MD18-T載體的連接、轉(zhuǎn)化并檢測;構(gòu)建融合表達載體p GL4.17,將目的基因插入luc2報告基因前面;去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細胞后進行熒光素酶活性檢測。3)經(jīng)分析,h WAPL基因核心啟動子位于h WAPL基因上游-1317—-1bp區(qū)域內(nèi)。4)將h WAPL基因上游-1317—-1bp區(qū)域分為三段,分別是-900—-1bp,-600—-1bp,-300—-1bp,分別利用熒光素酶檢測實驗進行分析,步驟同上。結(jié)果h WAPL基因核心啟動子位于h WAPL基因上游-300—-1bp內(nèi)。第二部分h WAPL基因轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學預測和c-Myc蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性的研究目的對h WAPL基因轉(zhuǎn)錄因子進行生物信息學預測,研究c-Myc蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性方法根據(jù)h WAPL基因啟動子所在區(qū)域,利用生物信息學方法對h WAPL基因的轉(zhuǎn)錄因子進行預測。根據(jù)FRANSFAC數(shù)據(jù)庫的PWM預測算法、ENCODE數(shù)據(jù)的預測算法和JASPAR數(shù)據(jù)的預測算法等三種預測對h WAPL基因轉(zhuǎn)錄因子進行預測。選擇三種預測結(jié)果交集中的c-Myc蛋白研究對象,驗證c-Myc蛋白是否為h WAPL基因的轉(zhuǎn)錄因子。c-Myc蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性的研究利用酵母雙雜交的自激活實驗。1)載體構(gòu)建:構(gòu)建c-Myc-p GBKT7載體;2)準備酵母細胞AH109感受態(tài)細胞;3)p GBKT7載體和p GADT7載體共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109,克隆至SD/ Leu/ Trp,挑取克隆至SD/ Ade/ His/ Leu/ Trp培養(yǎng)基上培養(yǎng);4)X-gal檢測實驗,將四缺SD/ Ade/ His/ Leu/ Trp培養(yǎng)基平皿上的克隆轉(zhuǎn)接到新的含有X-gal的選擇性四缺培養(yǎng)基上,觀察克隆是否變藍。結(jié)果1)在三種預測結(jié)果的交集中,c-Myc蛋白是h WAPL基因的轉(zhuǎn)錄因子之一。2)酵母雙雜交結(jié)果顯示所有共轉(zhuǎn)BD和AD載體的Y187菌株在二缺培養(yǎng)基上都長出了克隆,說明共轉(zhuǎn)化成功。3)將SD/ Leu/ Trp培養(yǎng)基上的克隆挑取至SD/ Ade/ His/ Leu/ Trp培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),除了共轉(zhuǎn)化陰性對照組未長出克隆外,其余實驗組別均長出克隆。4)將SD/ Ade/ His/ Leu/ Trp上的克隆挑取至含有x-gal的SD/ Ade/ His/ Leu/ Trp上培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)克隆有變藍,此實驗結(jié)果說明c-myc蛋白有自激活活性。第三部分c-Myc蛋白和h WAPL基因核心啟動子的關(guān)系研究目的研究c-Myc蛋白能否和h WAPL基因核心啟動子所在區(qū)域結(jié)合,是否是h WAPL基因的轉(zhuǎn)錄因子方法應用酵母單雜交實驗。1)構(gòu)建c-Myc-p GADT7和h WAPL-p HIS2載體;2)準備酵母Y187感受態(tài)細胞;3)p GADT7和p HIS2共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187,克隆至選擇性的SD/-Trp-Leu-His并在加有3-amino-1,2,4-triazole(3-AT)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng);4)酵母單雜交,將c-Myc-p GADT7和h WAPL-p HIS2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌Y187,觀察酵母細胞能否在SD/-Trp-Leu-His并在加有3-amino-1,2,4-triazole(3-AT)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長。結(jié)果1)酵母雙雜交結(jié)果顯示所有共轉(zhuǎn)p HIS2和AD載體的Y187菌株在二缺培養(yǎng)基上都長出了克隆,說明共轉(zhuǎn)化成功。2)將SD/ Leu/ Trp培養(yǎng)基上的克隆挑取至SD/ His/ Leu/ Trp(含20m M的3-AT)平皿中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),所有實驗組別都正常長出克隆,說明20m M的3-AT不足以抑制實驗組的組氨酸表達;3)將3-AT含量進一步加大到40m M,將克隆挑取至SD/ His/ Leu/ Trp(含40m M的3-AT)平皿中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),除了陽性對照組可以正常長出克隆外,其余組別均未長出克隆,此實驗結(jié)果說明c-Myc蛋白和h WAPL基因的核心啟動子并不存在結(jié)合情況。結(jié)論1.h WAPL基因核心啟動子位于h WAPL基因上游-300—-1bp內(nèi)。2.c-Myc蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性。3.c-Myc蛋白不能和h WAPL基因核心啟動子所在區(qū)域結(jié)合。4.c-Myc蛋白不是h WAPL基因的轉(zhuǎn)錄因子。
[Abstract]:Human cervical cancer ( WAPL ) gene is one of the most important malignant tumors in the world . The expression of c - Myc gene is very important in the early diagnosis , gene diagnosis and biological treatment of cervical cancer . The transcription factors of h WAPL gene were predicted by means of bioinformatics . 鍏嬮殕鑷砈D/ Leu/ Trp,鎸戝彇鍏嬮殕鑷砈D/ Ade/ His/ Leu/ Trp鍩瑰吇鍩轟笂鍩瑰吇;4)X-gal媯，

本文編號：1826997