本文選題：補(bǔ)腎助孕方 + 逍遙丸　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:研究補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)人子宮內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的影響及其促進(jìn)血管新生的作用,探討兩法改善子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制,并比較補(bǔ)腎法與疏肝法的異同。方法:1人子宮內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human endometrial microvascular endothelial cells,HEMEC)用含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育,待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶90%左右時(shí)用0.25%胰酶?jìng)鞔?傳代后用于實(shí)驗(yàn)。2含藥血清制備選取12名年齡在20~30周歲,身體健康的女性志愿者,簽訂知情同意書。將12人隨機(jī)分為3組。其中補(bǔ)腎組和疏肝組分別口服補(bǔ)腎助孕方和逍遙丸3天,于第4日晨起空腹服用全天劑量,1h后靜脈取血5ml。正常組常規(guī)飲食,第4天清晨空腹靜脈采血5ml。室溫靜置,離心取上清,56℃水浴滅活補(bǔ)體,過濾除菌,得補(bǔ)腎助孕方、逍遙丸人含藥血清和正常人血清,-20℃保存?zhèn)溆谩?分組3.1常規(guī)傳代內(nèi)皮細(xì)胞,低血清培養(yǎng)24小時(shí)。40ng/ml的VEGF刺激細(xì)胞不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h),檢測(cè)細(xì)胞VEGFR-2以及增殖相關(guān)指標(biāo)PCNA、細(xì)胞周期相關(guān)基因CyclinD1、遷移相關(guān)指標(biāo)MMP9的蛋白和mRNA水平;CCK8法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力;細(xì)胞劃痕法觀察內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力;內(nèi)皮細(xì)胞株小管形成實(shí)驗(yàn)觀察VEGF對(duì)血管生成的影響。給予VEGF(40ng/ml)孵育細(xì)胞短時(shí)間點(diǎn)(0min、15min、30min、60min),檢測(cè)MAPK信號(hào)通路(p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-P38、P38)的變化。3.2傳代內(nèi)皮細(xì)胞,低血清培養(yǎng)24h后,分別給予補(bǔ)腎助孕方和逍遙丸預(yù)孵育細(xì)胞24小時(shí),實(shí)驗(yàn)分組具體為:對(duì)照組、VEGF組、補(bǔ)腎組、疏肝組。檢測(cè)VEGF和VEGFr-2的蛋白和mrna水平,觀察補(bǔ)腎法和疏肝法對(duì)VEGF和VEGFr-2的影響。3.3傳代內(nèi)皮細(xì)胞,低血清培養(yǎng)24h后,分別給予補(bǔ)腎助孕方和逍遙丸預(yù)孵育細(xì)胞24小時(shí),再給予VEGF(40ng/ml)刺激內(nèi)皮細(xì)胞,分組具體為:對(duì)照組、VEGF組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組,觀察增殖遷移指標(biāo)及相關(guān)信號(hào)通路指標(biāo)的變化;cck8法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力;細(xì)胞劃痕法觀察內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力;內(nèi)皮細(xì)胞株小管形成實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)腎法和疏肝法對(duì)血管生成的影響。闡明補(bǔ)腎法和疏肝法對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移的影響,并比較兩者之異同。3.4傳代內(nèi)皮細(xì)胞,低血清培養(yǎng)24h后,給予補(bǔ)腎助孕方和逍遙丸預(yù)孵育細(xì)胞24小時(shí),再用erk通路抑制劑pd98059、jnk通路抑制劑sp600125和p38通路抑制劑sb203580分別孵育細(xì)胞2h,再給予VEGF(40ng/ml)刺激內(nèi)皮細(xì)胞,具體分組如下:對(duì)照組、VEGF組、抑制劑+VEGF組、補(bǔ)腎組(疏肝組)、補(bǔ)腎+VEGF組(疏肝+VEGF組)、補(bǔ)腎+抑制劑+VEGF組(疏肝+抑制劑+VEGF組),檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移與mapk信號(hào)通路的相關(guān)指標(biāo)。闡明補(bǔ)腎法及疏肝法通過哪條信號(hào)通路影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移,并比較兩者之異同。4檢測(cè)方法采用westernblot法檢測(cè)VEGF、VEGFr-2、pcna、cyclind1、mmp9、erk、p-erk、jnk、p-jnk、p38、p-p38蛋白的表達(dá);采用realtimepcr法檢測(cè)VEGF、VEGFr-2、pcna、cyclind1、mmp9mrna的表達(dá);cck8法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力;細(xì)胞劃痕法觀察內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力;內(nèi)皮細(xì)胞小管形成能力觀察內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力。結(jié)果:1VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間(0h、6h、12h、24h),VEGFr-2、pcna、cyclind1、mmp9的mrna及蛋白水平呈時(shí)間依賴性逐漸增高,12小時(shí)達(dá)高峰(p0.05),24小時(shí)仍在較高水平。cck8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力,od值在12小時(shí)達(dá)高峰(p0.05)。細(xì)胞劃痕法觀察內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力;內(nèi)皮細(xì)胞小管形成實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)皮細(xì)胞管狀形成能力;結(jié)果顯示VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移,促進(jìn)血管新生。以上結(jié)果表明,VEGF可促進(jìn)人子宮內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,進(jìn)而促進(jìn)血管新生。VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞不同短時(shí)間點(diǎn)(0min、15min、30min、60min),westernblot法檢測(cè)mapk信號(hào)通路,結(jié)果顯示:p-erk蛋白在15min時(shí)表達(dá)最高(p0.05);p-jnk和p-p38蛋白在30min時(shí)表達(dá)最高(p0.05)。說明VEGF可激活mapk信號(hào)通路。2westernblot和實(shí)時(shí)定量pcr分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,VEGF組、補(bǔ)腎組、疏肝組的VEGF和VEGFr-2表達(dá)均升高(p0.05);與VEGF組比較,補(bǔ)腎組、疏肝組的VEGF和VEGFr-2表達(dá)升高(p0.05);補(bǔ)腎組與疏肝組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。說明補(bǔ)腎法和疏肝法可促進(jìn)VEGF和VEGFr-2的表達(dá)。3傳代內(nèi)皮細(xì)胞,低血清培養(yǎng)24h后,分別給予補(bǔ)腎助孕方和逍遙丸預(yù)孵育細(xì)胞24小時(shí),再給予VEGF(40ng/ml)刺激內(nèi)皮細(xì)胞,分組具體為:對(duì)照組、VEGF組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組。結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,VEGF組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組的pcna、cyclind1、mmp9的mrna及蛋白水平均升高(p0.05),補(bǔ)腎+VEGF組pcna、cyclind1表達(dá)最高(p0.05),疏肝+VEGF組mmp9表達(dá)最高(p0.05);補(bǔ)腎+VEGF組均高于補(bǔ)腎組(p0.05),疏肝+VEGF組均高于疏肝組(p0.05)。兩法比較,pcna的mrna及蛋白表達(dá),補(bǔ)腎組優(yōu)于疏肝組(p0.05);mmp9的mrna及蛋白表達(dá),疏肝組優(yōu)于補(bǔ)腎組(p0.05);cyclind1的mrna及蛋白表達(dá),兩法比較無(wú)差異(p0.05)。cck8結(jié)果顯示VEGF組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組的od值均升高(p0.05);與VEGF組比較,補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組的od值均升高(p0.05),補(bǔ)腎法及疏肝法均與VEGF具有交互作用(p0.05)。細(xì)胞劃痕法和內(nèi)皮細(xì)胞小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,補(bǔ)腎法和疏肝法均可增加內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管狀形成,且補(bǔ)腎+VEGF組和疏肝+VEGF組的內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力及管狀形成能力最顯著。以上結(jié)果表明,補(bǔ)腎法和疏肝法通過促進(jìn)pcna、cyclind1、mmp9的表達(dá)增加內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移能力,補(bǔ)腎法促進(jìn)pcna的表達(dá)優(yōu)于疏肝法,疏肝法促進(jìn)mmp9的表達(dá)優(yōu)于補(bǔ)腎法。4補(bǔ)腎法和疏肝法通過激活不同信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。4.1補(bǔ)腎法通過mapk信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。Westernblot結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,VEGF組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎+VEGF組的p-erk、p-jnk、p-p38的蛋白表達(dá)均升高(p0.05);提示補(bǔ)腎法可激活mapk信號(hào)通路。分別給予erk信號(hào)通路抑制劑pd98059,jnk信號(hào)通路抑制劑sp600125,p38信號(hào)通路抑制劑sb203580孵育后,進(jìn)行westernblot分析,結(jié)果顯示:與補(bǔ)腎組相比,補(bǔ)腎+pd98059+VEGF組的pcna和cyclind1的蛋白表達(dá)降低(p0.05);補(bǔ)腎+sp600125+VEGF組,補(bǔ)腎+sb203580+VEGF組的cyclind1及mmp9的蛋白表達(dá)均降低(p0.05);提示補(bǔ)腎法通過激活erk信號(hào)通路促進(jìn)pcna蛋白表達(dá),通過激活erk,jnk,p38信號(hào)通路促進(jìn)cyclind1蛋白表達(dá),通過激活jnk、p38信號(hào)通路促進(jìn)mmp9蛋白表達(dá)。4.2疏肝法通過jnk和p38信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移。Westernblot結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組的p-erk、p-jnk、p-p38的蛋白表達(dá)均升高(p0.05);提示疏肝法可激活mapk信號(hào)通路。分別給予erk信號(hào)通路抑制劑pd98059,jnk信號(hào)通路抑制劑sp600125,p38信號(hào)通路抑制劑sb203580孵育后,進(jìn)行westernblot分析,結(jié)果顯示:與疏肝組相比,疏肝+sp600125+VEGF組的cyclind1蛋白表達(dá)降低(p0.05);疏肝+sb203580+VEGF組的pcna、cyclind1及mmp9的蛋白表達(dá)均降低(p0.05),以上結(jié)果說明,疏肝法通過激活jnk,p38信號(hào)通路促進(jìn)cyclind1蛋白表達(dá),通過激活p38信號(hào)通路促進(jìn)pcna和mmp9蛋白表達(dá)。結(jié)論:1VEGF及VEGFr-2是位于mapk信號(hào)通路的上游始動(dòng)因子,能夠激活mapk(erk、jnk、p38)信號(hào)通路,上調(diào)增殖、遷移指標(biāo)pcna、cyclind1、mmp9的表達(dá),促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管新生,進(jìn)而改善子宮內(nèi)膜容受性。2補(bǔ)腎法及疏肝法均能上調(diào)子宮內(nèi)膜血管VEGF及VEGFr-2的表達(dá),從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管新生,改善子宮內(nèi)膜容受性。3補(bǔ)腎法與疏肝法通過提高子宮內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞pcna、cyclind1、mmp9的蛋白及mrna表達(dá),促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移。補(bǔ)腎法提高PCNA的表達(dá)作用比疏肝法更顯著;疏肝法提高M(jìn)MP9的表達(dá)作用比補(bǔ)腎法更顯著。提示補(bǔ)腎法在促進(jìn)細(xì)胞增殖能力上優(yōu)于疏肝法,而在細(xì)胞遷移方面則疏肝法優(yōu)于補(bǔ)腎法。補(bǔ)腎法及疏肝法均和VEGF具有協(xié)同作用,聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管新生的作用更強(qiáng)。4補(bǔ)腎法與疏肝法均可以激活子宮內(nèi)膜血管MAPK信號(hào)通路家族中的ERK、JNK、P38 MAPK信號(hào)通路。其機(jī)制可能是通過激活VEGF與其受體VEGFR-2相結(jié)合,進(jìn)而募集MAPK信號(hào)通路的ERK、JNK、P38,使其發(fā)生磷酸化而活化,進(jìn)一步調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。5補(bǔ)腎法和疏肝法可以多通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移,最終促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管新生。補(bǔ)腎法通過激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)PCNA表達(dá),激活ERK、JNK、P38信號(hào)通路促進(jìn)CyclinD1表達(dá),激活JNK、P38信號(hào)通路促進(jìn)MMP9的表達(dá);疏肝法通過P38信號(hào)通路促進(jìn)PCNA和MMP9的表達(dá),通過JNK、P38促進(jìn)CyclinD1表達(dá)。
[Abstract]:Objective : To study the effects of Bushen and Shugan on the proliferation and migration of vascular endothelial cells in human endometrium . The effects of Bushen and Shugan on the proliferation and migration of endothelial cells were observed in the control group , VEGF group , Bushen group , Bushen + VEGF group , Bushen + VEGF group ( Shugan + VEGF group ) , Bushen + VEGF group ( Shugan group ) , Bushen + VEGF group ( Shugan + VEGF group ) , Bushen + VEGF group ( Shugan + VEGF group ) , Bushen + VEGF group ( Shugan + inhibitor + VEGF group ) . The expression of VEGF , VEGFr - 2 , pcna , cyclin d1 , mmp9mRNA in endothelial cells was detected by the method of real time polymerase chain reaction ( PCR ) . The results showed that the expression of VEGF and VEGFr - 2 in endothelial cells increased significantly ( P < 0.05 ) . The results showed that VEGF stimulated endothelial cell migration and promoted angiogenesis . The results showed that VEGF could promote endothelial cell migration and promote angiogenesis .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1818266