發(fā)布時間：2018-04-29 03:42

  本文選題：補腎助孕方 + 逍遙丸�。� 參考：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:研究補腎法、疏肝法對人子宮內膜微血管內皮細胞增殖、遷移的影響及其促進血管新生的作用,探討兩法改善子宮內膜容受性的作用機制,并比較補腎法與疏肝法的異同。方法:1人子宮內膜微血管內皮細胞的培養(yǎng)人子宮內膜微血管內皮細胞(Human endometrial microvascular endothelial cells,HEMEC)用含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育,待細胞長滿培養(yǎng)瓶90%左右時用0.25%胰酶傳代,傳代后用于實驗。2含藥血清制備選取12名年齡在20~30周歲,身體健康的女性志愿者,簽訂知情同意書。將12人隨機分為3組。其中補腎組和疏肝組分別口服補腎助孕方和逍遙丸3天,于第4日晨起空腹服用全天劑量,1h后靜脈取血5ml。正常組常規(guī)飲食,第4天清晨空腹靜脈采血5ml。室溫靜置,離心取上清,56℃水浴滅活補體,過濾除菌,得補腎助孕方、逍遙丸人含藥血清和正常人血清,-20℃保存?zhèn)溆谩?分組3.1常規(guī)傳代內皮細胞,低血清培養(yǎng)24小時。40ng/ml的VEGF刺激細胞不同時間(0h、6h、12h、24h),檢測細胞VEGFR-2以及增殖相關指標PCNA、細胞周期相關基因CyclinD1、遷移相關指標MMP9的蛋白和mRNA水平;CCK8法檢測內皮細胞的增殖能力;細胞劃痕法觀察內皮細胞的遷移能力;內皮細胞株小管形成實驗觀察VEGF對血管生成的影響。給予VEGF(40ng/ml)孵育細胞短時間點(0min、15min、30min、60min),檢測MAPK信號通路(p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-P38、P38)的變化。3.2傳代內皮細胞,低血清培養(yǎng)24h后,分別給予補腎助孕方和逍遙丸預孵育細胞24小時,實驗分組具體為:對照組、VEGF組、補腎組、疏肝組。檢測VEGF和VEGFr-2的蛋白和mrna水平,觀察補腎法和疏肝法對VEGF和VEGFr-2的影響。3.3傳代內皮細胞,低血清培養(yǎng)24h后,分別給予補腎助孕方和逍遙丸預孵育細胞24小時,再給予VEGF(40ng/ml)刺激內皮細胞,分組具體為:對照組、VEGF組、補腎組、補腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組,觀察增殖遷移指標及相關信號通路指標的變化;cck8法檢測內皮細胞的增殖能力;細胞劃痕法觀察內皮細胞的遷移能力;內皮細胞株小管形成實驗觀察補腎法和疏肝法對血管生成的影響。闡明補腎法和疏肝法對內皮細胞增殖遷移的影響,并比較兩者之異同。3.4傳代內皮細胞,低血清培養(yǎng)24h后,給予補腎助孕方和逍遙丸預孵育細胞24小時,再用erk通路抑制劑pd98059、jnk通路抑制劑sp600125和p38通路抑制劑sb203580分別孵育細胞2h,再給予VEGF(40ng/ml)刺激內皮細胞,具體分組如下:對照組、VEGF組、抑制劑+VEGF組、補腎組(疏肝組)、補腎+VEGF組(疏肝+VEGF組)、補腎+抑制劑+VEGF組(疏肝+抑制劑+VEGF組),檢測內皮細胞增殖、遷移與mapk信號通路的相關指標。闡明補腎法及疏肝法通過哪條信號通路影響內皮細胞增殖遷移,并比較兩者之異同。4檢測方法采用westernblot法檢測VEGF、VEGFr-2、pcna、cyclind1、mmp9、erk、p-erk、jnk、p-jnk、p38、p-p38蛋白的表達;采用realtimepcr法檢測VEGF、VEGFr-2、pcna、cyclind1、mmp9mrna的表達;cck8法檢測內皮細胞的增殖能力;細胞劃痕法觀察內皮細胞的遷移能力;內皮細胞小管形成能力觀察內皮細胞的血管生成能力。結果:1VEGF刺激內皮細胞不同時間(0h、6h、12h、24h),VEGFr-2、pcna、cyclind1、mmp9的mrna及蛋白水平呈時間依賴性逐漸增高,12小時達高峰(p0.05),24小時仍在較高水平。cck8法檢測細胞增殖活力,od值在12小時達高峰(p0.05)。細胞劃痕法觀察內皮細胞遷移能力;內皮細胞小管形成實驗觀察內皮細胞管狀形成能力;結果顯示VEGF促進內皮細胞遷移,促進血管新生。以上結果表明,VEGF可促進人子宮內膜微血管內皮細胞增殖、遷移,進而促進血管新生。VEGF刺激內皮細胞不同短時間點(0min、15min、30min、60min),westernblot法檢測mapk信號通路,結果顯示:p-erk蛋白在15min時表達最高(p0.05);p-jnk和p-p38蛋白在30min時表達最高(p0.05)。說明VEGF可激活mapk信號通路。2westernblot和實時定量pcr分析結果顯示,與對照組比較,VEGF組、補腎組、疏肝組的VEGF和VEGFr-2表達均升高(p0.05);與VEGF組比較,補腎組、疏肝組的VEGF和VEGFr-2表達升高(p0.05);補腎組與疏肝組比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。說明補腎法和疏肝法可促進VEGF和VEGFr-2的表達。3傳代內皮細胞,低血清培養(yǎng)24h后,分別給予補腎助孕方和逍遙丸預孵育細胞24小時,再給予VEGF(40ng/ml)刺激內皮細胞,分組具體為:對照組、VEGF組、補腎組、補腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組。結果顯示:與對照組比較,VEGF組、補腎組、補腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組的pcna、cyclind1、mmp9的mrna及蛋白水平均升高(p0.05),補腎+VEGF組pcna、cyclind1表達最高(p0.05),疏肝+VEGF組mmp9表達最高(p0.05);補腎+VEGF組均高于補腎組(p0.05),疏肝+VEGF組均高于疏肝組(p0.05)。兩法比較,pcna的mrna及蛋白表達,補腎組優(yōu)于疏肝組(p0.05);mmp9的mrna及蛋白表達,疏肝組優(yōu)于補腎組(p0.05);cyclind1的mrna及蛋白表達,兩法比較無差異(p0.05)。cck8結果顯示VEGF組、補腎組、補腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組的od值均升高(p0.05);與VEGF組比較,補腎組、補腎+VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組的od值均升高(p0.05),補腎法及疏肝法均與VEGF具有交互作用(p0.05)。細胞劃痕法和內皮細胞小管形成實驗結果顯示,補腎法和疏肝法均可增加內皮細胞的遷移能力,促進內皮細胞管狀形成,且補腎+VEGF組和疏肝+VEGF組的內皮細胞遷移能力及管狀形成能力最顯著。以上結果表明,補腎法和疏肝法通過促進pcna、cyclind1、mmp9的表達增加內皮細胞的增殖遷移能力,補腎法促進pcna的表達優(yōu)于疏肝法,疏肝法促進mmp9的表達優(yōu)于補腎法。4補腎法和疏肝法通過激活不同信號通路促進內皮細胞增殖、遷移。4.1補腎法通過mapk信號通路促進內皮細胞增殖、遷移。Westernblot結果顯示:與對照組比較,VEGF組、補腎組、補腎+VEGF組的p-erk、p-jnk、p-p38的蛋白表達均升高(p0.05);提示補腎法可激活mapk信號通路。分別給予erk信號通路抑制劑pd98059,jnk信號通路抑制劑sp600125,p38信號通路抑制劑sb203580孵育后,進行westernblot分析,結果顯示:與補腎組相比,補腎+pd98059+VEGF組的pcna和cyclind1的蛋白表達降低(p0.05);補腎+sp600125+VEGF組,補腎+sb203580+VEGF組的cyclind1及mmp9的蛋白表達均降低(p0.05);提示補腎法通過激活erk信號通路促進pcna蛋白表達,通過激活erk,jnk,p38信號通路促進cyclind1蛋白表達,通過激活jnk、p38信號通路促進mmp9蛋白表達。4.2疏肝法通過jnk和p38信號通路促進內皮細胞增殖、遷移。Westernblot結果顯示:與對照組比較,VEGF組、疏肝組、疏肝+VEGF組的p-erk、p-jnk、p-p38的蛋白表達均升高(p0.05);提示疏肝法可激活mapk信號通路。分別給予erk信號通路抑制劑pd98059,jnk信號通路抑制劑sp600125,p38信號通路抑制劑sb203580孵育后,進行westernblot分析,結果顯示:與疏肝組相比,疏肝+sp600125+VEGF組的cyclind1蛋白表達降低(p0.05);疏肝+sb203580+VEGF組的pcna、cyclind1及mmp9的蛋白表達均降低(p0.05),以上結果說明,疏肝法通過激活jnk,p38信號通路促進cyclind1蛋白表達,通過激活p38信號通路促進pcna和mmp9蛋白表達。結論:1VEGF及VEGFr-2是位于mapk信號通路的上游始動因子,能夠激活mapk(erk、jnk、p38)信號通路,上調增殖、遷移指標pcna、cyclind1、mmp9的表達,促進子宮內膜血管新生,進而改善子宮內膜容受性。2補腎法及疏肝法均能上調子宮內膜血管VEGF及VEGFr-2的表達,從而促進子宮內膜血管新生,改善子宮內膜容受性。3補腎法與疏肝法通過提高子宮內膜微血管內皮細胞pcna、cyclind1、mmp9的蛋白及mrna表達,促進內皮細胞的增殖與遷移。補腎法提高PCNA的表達作用比疏肝法更顯著;疏肝法提高MMP9的表達作用比補腎法更顯著。提示補腎法在促進細胞增殖能力上優(yōu)于疏肝法,而在細胞遷移方面則疏肝法優(yōu)于補腎法。補腎法及疏肝法均和VEGF具有協(xié)同作用,聯(lián)合應用促進子宮內膜血管新生的作用更強。4補腎法與疏肝法均可以激活子宮內膜血管MAPK信號通路家族中的ERK、JNK、P38 MAPK信號通路。其機制可能是通過激活VEGF與其受體VEGFR-2相結合,進而募集MAPK信號通路的ERK、JNK、P38,使其發(fā)生磷酸化而活化,進一步調控信號轉導。5補腎法和疏肝法可以多通路促進子宮內膜微血管內皮細胞的增殖遷移,最終促進子宮內膜血管新生。補腎法通過激活ERK信號通路促進PCNA表達,激活ERK、JNK、P38信號通路促進CyclinD1表達,激活JNK、P38信號通路促進MMP9的表達;疏肝法通過P38信號通路促進PCNA和MMP9的表達,通過JNK、P38促進CyclinD1表達。
[Abstract]:Objective : To study the effects of Bushen and Shugan on the proliferation and migration of vascular endothelial cells in human endometrium . The effects of Bushen and Shugan on the proliferation and migration of endothelial cells were observed in the control group , VEGF group , Bushen group , Bushen + VEGF group , Bushen + VEGF group ( Shugan + VEGF group ) , Bushen + VEGF group ( Shugan group ) , Bushen + VEGF group ( Shugan + VEGF group ) , Bushen + VEGF group ( Shugan + VEGF group ) , Bushen + VEGF group ( Shugan + inhibitor + VEGF group ) . The expression of VEGF , VEGFr - 2 , pcna , cyclin d1 , mmp9mRNA in endothelial cells was detected by the method of real time polymerase chain reaction ( PCR ) . The results showed that the expression of VEGF and VEGFr - 2 in endothelial cells increased significantly ( P < 0.05 ) . The results showed that VEGF stimulated endothelial cell migration and promoted angiogenesis . The results showed that VEGF could promote endothelial cell migration and promote angiogenesis .

【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714.8

【參考文獻】

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本文編號：1818266