本文選題：輔助生殖技術(shù) + 雌激素　； 參考：《南京醫(yī)科大學》2016年碩士論文

【摘要】：目的：IVF周期中大劑量促排卵藥物使用后多卵泡同時發(fā)育所產(chǎn)生的超生理劑量的雌激素水平被認為和ART不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)ART來源胎盤緊密連接功能異常,由此推測IVF周期高雌激素可能通過胎盤緊密連接進而影響滋養(yǎng)細胞侵襲能力,引發(fā)相關(guān)妊娠合并癥。前期實驗室已建立滋養(yǎng)細胞體外培養(yǎng)模型,通過免疫熒光開展了滋養(yǎng)細胞緊密連接因子的表達和定位研究,并通過跨上皮電阻和細胞旁滲透性的測定實現(xiàn)了緊密連接功能的評估。本研究檢測正常自然妊娠女性妊娠早期和足月分娩時外周血、絨毛組織或胎盤組織中雌二醇(E2)水平以及足月分娩時臍動脈血E2水平；擬探討生理和超生理濃度雌激素對滋養(yǎng)細胞緊密連接功能及侵襲能力的影響；進一步研究IVF超生理雌激素水平和不良妊娠結(jié)局關(guān)聯(lián),為優(yōu)化ART條件、提高ART技術(shù)安全性提供新的依據(jù)。材料和方法：(1)本研究納入20例非意愿妊娠行妊娠早期流產(chǎn)者、20例足月妊娠行剖宮產(chǎn)者,采用化學發(fā)光免疫分析(CLIA)檢測妊娠早期流產(chǎn)絨毛組織、孕婦外周血以及分娩時孕婦外周血、臍動脈血和胎盤組織中E2水平。(2)利用Millicell小室系統(tǒng)培養(yǎng)BeWo細胞,建立體外滋養(yǎng)層細胞單層培養(yǎng)模型。(3)利用不同濃度(OM.5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M.5×10-10M) 17β-E2作用BeWo細胞一定時間(1h、3h、6h、12h、24h)后,分別通過測定細胞跨上皮電阻(Transepithelial electrical resistance,TEER)和細胞旁滲透性的改變(Paracellular permeability,CPP)的改變,評估雌激素作用下滋養(yǎng)層緊密連接功能的改變。(4)確定處理BeWo細胞12小時的選擇,該時間點作用BeWo細胞能最大程度反映雌激素處理細胞后改變。通過Western Blot檢測緊密連接因子ZO-1、OCLN、CLDN3、CLDN4、CLDN5、CLDN8在不同濃度17β-E2處理12h后蛋白水平表達改變。(5)利用免疫熒光技術(shù)檢測一定濃度的17β-E2處理BeWo細胞12h后緊密連接因子細胞定位的變化,研究雌激素對緊密連接功能改變的可能原因。(6)體外培養(yǎng)BeWo細胞,CCK-8實驗檢測不同濃度(0M、5×10-7M、5×10-8M. 5×10-9M、5×10-10M)17β-E2作用BeWo細胞12h后細胞活力改變,確定該條件的選擇可以用于后續(xù)的BeWo細胞侵襲實驗。(7)利用以上實驗條件,細胞體外侵襲實驗(Transwell Matrigel Invasion Assay)檢測細胞侵襲能力的改變。并進一步通過Western Blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2和9 (MMP2、MMP9)的表達,探討高雌激素導致滋養(yǎng)層細胞侵襲能力受損的可能原因。結(jié)果(1)妊娠早期的孕婦血清E2濃度[(3.44±1.30) nmol/L]低于足月妊娠孕婦[(509.78±197.82) nmol/L] (t=10.2, P0.001);而孕早期絨毛組織中E2濃度[(30.82±13.91) pmol/mg]顯著高于足月胎盤組織中E2濃度[(17.21±5.37) pmol/mg] (t=4.1, P0.001)).(2)利用Millicell小室體外培養(yǎng)BeWo細胞,通過TEER測定和CPP分析評估不同濃度(OM,5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M.5×10-10M)雌激素對滋養(yǎng)層細胞作用不同時間后,對其緊密連接功能的影響。結(jié)果顯示不同濃度17β-E2處理BeWo細胞1h和3h后,其TEER均無明顯變化(P0.05)；5×10"7M、5×10-8M的17β-E2處理BeWo細胞6h后,其TEER顯著降低,CPP顯著升高(P0.05)；(3) 5×10-7、5×10-8M、5×10-9M的17β-E2處理BeWo細胞12h和24h后,其TEER顯著降低,CPP顯著升高(P0.05)。其中在12h,17β-E2對BeWo的處理效應最為明顯,且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。(4)不同濃度17β-E2作用BeWo細胞12h后Western Blot檢測各緊密連接因子蛋白水平的表達,發(fā)現(xiàn)OCLN在5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M雌激素水平表達量下調(diào)(P0.05); CLDN3在5×10"7M、5×10-8M雌激素水平表達量下調(diào)(P0.05)；其他緊密連接因子表達量無明顯改變(P0.05)。5×10-7M 17β-E2處理BeWo細胞12h后,免疫熒光結(jié)果顯示OCLN和CLDN3表達量下調(diào),CLDN5呈現(xiàn)出從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核的現(xiàn)象。(5)體外培養(yǎng)BeWo細胞,CCK-8實驗檢測不同濃度(0M、5×10-7M、 5×10-8M、 5×10-9M、5×10-10M) 17β-E2作用BeWo細胞12h,細胞活力沒有明顯改變(P0.05)。(6)細胞體外侵襲實驗顯示僅5×10-7M、5×10-8M雌激素作用BeWo細胞12后,BeWo細胞侵襲能力下降；Western Blot結(jié)果顯示同等條件下MMP2表達下調(diào)(P0.05),MMP9無明顯改變(P0.05)。結(jié)論：(1)正常自然妊娠的早期絨毛組織中含有高濃度的E2,足月分娩時胎盤組織中E2相對較低。(2)本研究以BeWo細胞為模型,發(fā)現(xiàn)高水平雌激素可引起胎盤滋養(yǎng)層細胞緊密連接功能的破壞,提示ART促排產(chǎn)生的高雌激素水平可能會通過影響滋養(yǎng)層細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)進而影響胎盤功能的正常發(fā)揮。(3)高水平雌激素可以導致BeWo細胞侵襲功能受損,提示ART促排產(chǎn)生的高雌激素水平可能會影響滋養(yǎng)層細胞侵襲功能,導致胎盤功能異常,參與了妊娠期胎盤相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。(4)本研究的結(jié)果,為優(yōu)化ART條件、提高ART技術(shù)安全性提供新的依據(jù)。
[Abstract]:Objective : To investigate the relationship between estradiol ( E2 ) levels and E2 levels in peripheral blood , chorionic villi and placenta tissues of normal natural pregnant women during early and full term labor , and the E2 level of umbilical artery blood during the early and term delivery of normal natural pregnant women .
To investigate the effects of physiological and physiological concentrations of estrogen on the tight junction function and invasion ability of trophoblasts ;
In order to optimize ART conditions and to improve the safety of ART , the changes of serum levels of E2 in peripheral blood , umbilical artery blood and placental tissue of pregnant women with early abortion were determined by using the method of chemiluminescence immunoassay ( CLIA ) . ( 6 ) In vitro culture of BeWo cells , CCK - 8 assay was used to detect the changes of cell activity after 12 hours of BeWo cell invasion . The results showed that the serum E2 concentration in the early pregnancy was significantly higher than that in the term placental tissue ( 17.21 鹵 7.82 ) nmol / L ( t = 10.2 , P0.001 ) .
After 6 h of BeWo cell , the TEER of 5 脳 10 " 7 M , 5 脳 10 - 8M BeWo cells decreased significantly and CPP increased significantly ( P0.05 ) .
( 3 ) After 12 h and 24 h treatment of BeWo cells at 5 脳 10 - 7 , 5 脳 10 - 8M , 5 脳 10 - 9M , the TEER decreased significantly and CPP increased significantly ( P0.05 ) .
After 12 h treatment of BeWo cells with 5 脳 10 - 7 M 17 尾 - E2 , the results showed that the expression of OCLN and CLDN3 was down regulated and CLDN5 appeared to be transferred from cytoplasm to nucleus .
Conclusion : ( 1 ) High levels of estrogen may affect the function of placental trophoblasts . ( 2 ) High levels of estrogen may affect the function of placental function . ( 3 ) High levels of estrogen may affect the invasion function of trophoblasts .

【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R714.8

【參考文獻】

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1 張園;趙楠楠;趙海君;崔毓桂;劉嘉茵;;緊密連接結(jié)構(gòu)中相關(guān)蛋白在自然妊娠和輔助生殖技術(shù)來源胎盤組織中的表達[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2014年02期

2 朱穎;吳敏;吳超英;夏革清;;Role of Progesterone in TLR4-MyD88-dependent Signaling Pathway in Pre-eclampsia[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年05期

3 湯麗莎;張園;趙海君;駱秀翠;高莉;崔毓桂;劉嘉茵;;VEGFR3在自然妊娠和輔助生殖技術(shù)來源胎盤中的定位[J];江蘇醫(yī)藥;2012年04期

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本文編號：1805803