本文選題：子癇前期　切入點：胎盤　出處：《華中科技大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分 子癇前期中maspin的表達及其啟動子甲基化狀態(tài)的研究目的：本部分研究maspin蛋白在子癇前期患者胎盤組織中的表達水平及maspin基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)；利用體外實驗研究缺氧時絨毛外滋養(yǎng)細胞中maspin基因啟動子區(qū)的甲基化程度,探討maspin基因啟動子區(qū)甲基化在子癇前期發(fā)病機制中的作用。方法：選取12例子癇前期患者作為子癇前期組,同時選12例正常妊娠孕婦作為對照組,兩組患者既往均無高血壓等內(nèi)外科疾病,子癇前期診斷標準參照謝幸主編的《婦產(chǎn)科學》第八版。以正常胎盤組織作為對照,運用Western blot方法檢測子癇前期胎盤組織中maspin蛋白的表達水平。提取子癇前期胎盤組織、絨毛外滋養(yǎng)細胞株(TEV-1)的基因組DNA,經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾,采用甲基化特異性PCR和亞硫酸氫鹽測序等分子生物學方法檢測子癇前期患者胎盤中和缺氧狀態(tài)下絨毛外滋養(yǎng)細胞株中maspin基因啟動子區(qū)域的甲基化情況。應用統(tǒng)計學軟件SPSS 18.0進行統(tǒng)計學分析,P值小于0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：子癇前期組胎盤組織中maspin蛋白的表達水平明顯高于對照組,在子癇前期胎盤組織中maspin啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。缺氧狀態(tài)下脫甲基化藥物(5-Aza-dC)可以使絨毛外滋養(yǎng)細胞株TEV-1的maspin基因啟動子區(qū)域甲基化水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論：子癇前期患者胎盤maspin蛋白表達明顯升高,而相應的maspin啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。缺氧狀態(tài)下脫甲基化藥物5-Aza-dC可以使絨毛外滋養(yǎng)細胞株TEV-1的maspin基因啟動子區(qū)域甲基化水平明顯降低,因此maspin基因啟動子區(qū)域甲基化及其表達水平的變化可能在子癇前期的發(fā)病機制中起到一定作用。第二部分 設計并合成靶向干擾maspin啟動子區(qū)的shRNA并驗證其對甲基化狀態(tài)的影響目的：針對maspin基因的啟動子區(qū)域設計特異性shRNA序列,構(gòu)建重組腺病毒,轉(zhuǎn)染至絨毛外滋養(yǎng)細胞株TEV-1,驗證shRNA對maspin啟動子甲基化的調(diào)控作用。方法：設計并合成靶向maspin基因啟動子區(qū)的shRNA序列,構(gòu)建4條shRNA質(zhì)粒表達載體pGenesil-1.1-maspin,酶切鑒定及DNA測序。將maspin-shRNA表達框通過體外同源重組的方式轉(zhuǎn)移至腺病毒表達載體上,將其轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝,制備獲得重組腺病毒。將鑒定正確的重組腺病毒轉(zhuǎn)染至絨毛外滋養(yǎng)細胞TEV-1,觀察細胞形態(tài)及GFP蛋白的表達,采用甲基化特異性PCR檢測轉(zhuǎn)染shRNA后TEV-1細胞中maspin基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果：經(jīng)酶切及DNA測序鑒定驗證重組腺病毒rAd5-maspin-shRNA構(gòu)建成功。并將其轉(zhuǎn)染至TEV-1細胞,平均轉(zhuǎn)染85%。與對照組相比,轉(zhuǎn)染重組腺病毒rAd5-maspin-shRNA后,maspin基因啟動子區(qū)的甲基化程度明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：成功構(gòu)建的重組腺病毒rAd5-maspin-shRNA,能高效轉(zhuǎn)染TEV-1細胞。shRNA靶向誘導maspin啟動子甲基化狀態(tài)由轉(zhuǎn)染前的低甲基化轉(zhuǎn)為高甲基化狀態(tài)。第三部分shRNA靶向誘導maspin啟動子甲基化對滋養(yǎng)細胞侵襲能力的影響研究目的：研究特異性shRNA靶向誘導maspm啟動子甲基化對滋養(yǎng)細胞侵襲、遷移能力的調(diào)控作用。方法：應用實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染后各組maspm基因的mRNA水平,Western blot印跡法檢測maspm蛋白的表達情況,利用Transwell體外遷移和侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后各組TEV-1細胞遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染特異性重組腺病毒rAd5-maspin-shRNA后,TEV-1細胞中maspin mRNA和蛋白的表達水平明顯下降(0.05),此外轉(zhuǎn)染后TEV-1細胞遷移和侵襲能力較對照組明顯增強,差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：重組maspin腺病毒rAd5-maspin-shRNA能有效地抑制maspin基因在TEV-1細胞株中的表達,同時明顯增強滋養(yǎng)細胞株TEV-1的遷移和侵襲能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.244

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本文編號：1728109