本文選題：子癇前期　切入點：胎盤　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分 子癇前期中maspin的表達(dá)及其啟動子甲基化狀態(tài)的研究目的：本部分研究maspin蛋白在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)水平及maspin基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)；利用體外實驗研究缺氧時絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞中maspin基因啟動子區(qū)的甲基化程度,探討maspin基因啟動子區(qū)甲基化在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：選取12例子癇前期患者作為子癇前期組,同時選12例正常妊娠孕婦作為對照組,兩組患者既往均無高血壓等內(nèi)外科疾病,子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》第八版。以正常胎盤組織作為對照,運用Western blot方法檢測子癇前期胎盤組織中maspin蛋白的表達(dá)水平。提取子癇前期胎盤組織、絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株(TEV-1)的基因組DNA,經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾,采用甲基化特異性PCR和亞硫酸氫鹽測序等分子生物學(xué)方法檢測子癇前期患者胎盤中和缺氧狀態(tài)下絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株中maspin基因啟動子區(qū)域的甲基化情況。應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P值小于0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：子癇前期組胎盤組織中maspin蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組,在子癇前期胎盤組織中maspin啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。缺氧狀態(tài)下脫甲基化藥物(5-Aza-dC)可以使絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株TEV-1的maspin基因啟動子區(qū)域甲基化水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：子癇前期患者胎盤maspin蛋白表達(dá)明顯升高,而相應(yīng)的maspin啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。缺氧狀態(tài)下脫甲基化藥物5-Aza-dC可以使絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株TEV-1的maspin基因啟動子區(qū)域甲基化水平明顯降低,因此maspin基因啟動子區(qū)域甲基化及其表達(dá)水平的變化可能在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中起到一定作用。第二部分 設(shè)計并合成靶向干擾maspin啟動子區(qū)的shRNA并驗證其對甲基化狀態(tài)的影響目的：針對maspin基因的啟動子區(qū)域設(shè)計特異性shRNA序列,構(gòu)建重組腺病毒,轉(zhuǎn)染至絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株TEV-1,驗證shRNA對maspin啟動子甲基化的調(diào)控作用。方法：設(shè)計并合成靶向maspin基因啟動子區(qū)的shRNA序列,構(gòu)建4條shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil-1.1-maspin,酶切鑒定及DNA測序。將maspin-shRNA表達(dá)框通過體外同源重組的方式轉(zhuǎn)移至腺病毒表達(dá)載體上,將其轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝,制備獲得重組腺病毒。將鑒定正確的重組腺病毒轉(zhuǎn)染至絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞TEV-1,觀察細(xì)胞形態(tài)及GFP蛋白的表達(dá),采用甲基化特異性PCR檢測轉(zhuǎn)染shRNA后TEV-1細(xì)胞中maspin基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果：經(jīng)酶切及DNA測序鑒定驗證重組腺病毒rAd5-maspin-shRNA構(gòu)建成功。并將其轉(zhuǎn)染至TEV-1細(xì)胞,平均轉(zhuǎn)染85%。與對照組相比,轉(zhuǎn)染重組腺病毒rAd5-maspin-shRNA后,maspin基因啟動子區(qū)的甲基化程度明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：成功構(gòu)建的重組腺病毒rAd5-maspin-shRNA,能高效轉(zhuǎn)染TEV-1細(xì)胞。shRNA靶向誘導(dǎo)maspin啟動子甲基化狀態(tài)由轉(zhuǎn)染前的低甲基化轉(zhuǎn)為高甲基化狀態(tài)。第三部分shRNA靶向誘導(dǎo)maspin啟動子甲基化對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的影響研究目的：研究特異性shRNA靶向誘導(dǎo)maspm啟動子甲基化對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、遷移能力的調(diào)控作用。方法：應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染后各組maspm基因的mRNA水平,Western blot印跡法檢測maspm蛋白的表達(dá)情況,利用Transwell體外遷移和侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后各組TEV-1細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染特異性重組腺病毒rAd5-maspin-shRNA后,TEV-1細(xì)胞中maspin mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯下降(0.05),此外轉(zhuǎn)染后TEV-1細(xì)胞遷移和侵襲能力較對照組明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：重組maspin腺病毒rAd5-maspin-shRNA能有效地抑制maspin基因在TEV-1細(xì)胞株中的表達(dá),同時明顯增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞株TEV-1的遷移和侵襲能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.244

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本文編號：1728109