本文選題：卵巢癌　切入點：順鉑耐藥　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：在女性常發(fā)的生殖器惡性腫瘤中卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率較高,其中85~90%為上皮性卵巢癌,對女性的身心健康造成了嚴重的威脅。病人的5年生存率處于30~40%的范圍內,由于早期的卵巢癌均沒有明顯的診斷指標,并且該疾病極易發(fā)生早期侵襲及轉移、病人對化療藥具有耐藥性,使其在女性所有惡性腫瘤中的死亡率排列第一。目前臨床上治療該病的規(guī)范化療法為聯合使用腫瘤細胞減滅術與術后使用紫杉醇和鉑類等藥物化療,但鉑類藥物涉及的耐藥性問題也值得關注。卵巢癌病人產生鉑類藥物耐藥性的過程需要多種因素相互作用,通過研究micro RNA一方面能夠從一定程度上闡述這種生物學效應,另一方面還有助于臨床上預測、或干涉耐藥性,microRNA除了能有效的調節(jié)細胞的生長、增殖、應激、凋亡及脂肪代謝等作用,體外研究結果同樣表明在卵巢癌耐藥機制中microRNA扮演著重要的角色。本實驗初步的探討了卵巢癌產生耐藥性的主要機制,分析microRNA在該過程中扮演了重要的角色,以期為未來相關領域尋找并分析疾病的鉑類耐藥性的治療靶點給予新的研究方向。microRNA主要存在于真核生物中,其包括的核苷酸數量約為20~25個,此類非編碼小分子RNA能夠介導基因轉錄后調控其表達水平,廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及細胞周期調控等過程。超過50%的microRNA存在于腫瘤細胞基因組中變異性較高的部位,如雜合性丟失區(qū)、脆性位點和基因組斷裂點等,以上區(qū)域是癌細胞發(fā)生染色體轉位、替換、丟失、基因擴增的主要部位。近幾年越來越多的研究發(fā)現micro RNA發(fā)揮著癌基因或抑癌基因樣作用,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、外侵轉移和轉歸預后等多個環(huán)節(jié)。雖然,近幾年有大量的研究表明microRNA與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系,但卵巢癌發(fā)病機制復雜,至今對卵巢癌早期診斷、治療和判斷預后仍然沒有特異性的指標。本研究利用基因芯片和RT-PCR對耐藥和敏感卵巢癌細胞系中microRNA的表達譜進行研究,尋找microRNA的差異表達,進一步研究差異表達顯著的microRNA在化療耐藥機制中的作用,為臨床逆轉卵巢癌耐藥、提高卵巢癌治療效果奠定理論基礎。第一部分耐藥及敏感卵巢癌細胞系中microrna的差異表達目的:利用基因芯片研究兩組卵巢癌細胞系skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1中microrna的表達譜,通過檢測耐藥及敏感卵巢癌細胞系中表達microrna的差異性,為未來相關領域尋找并分析卵巢癌的鉑類耐藥的治療靶點給予新的研究方向。方法:常規(guī)培養(yǎng)skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1細胞株,trizol法分別抽提總rna,對microrna分別進行cy3和cy5熒光標記,將所選細胞系與包含人類和小鼠的共924條microrna成熟的序列進行雜交,最后進行microrna微陣列芯片雜交檢測分析,獲得microrna表達譜,利用rt-pcr方法對篩選出的microrna進行可靠性驗證,鑒定出與卵巢癌耐藥相關的microrna。結果:1rna的質量檢測:從skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1細胞株提取出的總rna濃度值依次為:0.61、0.78、1.38及1.53(單位為μg/μl),a260/a280比值均處于1.9~2.0范圍內,瓊脂糖凝膠電泳實驗的結果顯示,清晰的條帶包括18s及28s,其亮度比大概等于1:2,提取的總rna純度符合研究要求,未發(fā)生顯著的降解。2microrna芯片測定結果:本研究經過cy3及cy5熒光顏色標記、純化、基因芯片雜交、圖像采集、數據進行歸一化處理后,分別以兩種細胞cy3、cy5熒光標記信號強度的比值為標準來判定差異表達的microrna。結果顯示:其中skov3/dppvsskov3細胞系中hsa-mir-99a-5p,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-34c-5p,hsa-mir-31-3p,hsa-mir-181d等19個micrornas高表達,hsa-mir-96-5p,hsa-mir-200c-3p,hsa-mir-193b-3p等20個micrornas低表達。coc1/dppvscoc1細胞系中hsa-mir-34a-5p,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-181c-3p等22個micrornas高表達,hsa-mir-892b,hsa-mir-505-5p等24個micrornas低表達。其中hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-181在兩種耐藥卵巢癌細胞系中均表達升高。結論:在耐藥及敏感卵巢癌細胞系skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1中microrna的表達譜存在明顯差異。在所有差異表達的micrornas中,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-181在兩種化療耐藥卵巢癌細胞系中表達水平均高于敏感細胞系,推測二者可能是在microrna水平與卵巢癌化療耐藥相關的指標,而且利用rt-pcr方法對mir-30a-5p,hsa-mir-181在兩種化療耐藥卵巢癌細胞系中進行可靠性驗證,與基因芯片的結果一致,且以mir-30a-5p升高最為顯著。第二部分microrna-30a-5p對卵巢癌耐藥細胞的影響目的:選擇敏感及耐藥卵巢癌細胞系中差異表達最顯著的microrna-30a-5p作為研究因子,探討microrna-30a-5p對卵巢癌細胞耐藥的影響,進一步驗證microrna芯片篩選的結果。方法:常規(guī)培養(yǎng)skov3/ddp及skov3細胞系,實時熒光定量rt-pcr方法測定細胞系中microrna-30a-5p的表達情況,同時檢測卵巢癌敏感及耐藥組織標本中microrna-30a-5p的表達情況。lipofectamin2000轉染microrna-30a-5ppre-mir、inhibitors至敏感及耐藥細胞中,通過熒光顯微鏡檢測轉染效率,mtt法檢測細胞增殖情況,細胞計數法檢測轉染后對細胞活性的影響。結果:1實時熒光定量rt-pcr方法測定細胞系和卵巢癌組織標本中microrna-30a-5p的表達情況:microrna-30a-5p在耐藥細胞株中的表達升高;在卵巢癌耐藥的組織標本中表達也升高,結果與細胞株microrna芯片結果一致。2skov3/ddp和skov3細胞轉染24h后microrna-30a-5p的表達改變:實時熒光定量rt-pcr結果顯示skov3細胞轉染pre-mir30a-5p24h后microrna-30a-5p的△ct為2.3,陰性對照組△ct為7.7。轉染pre-mir30a-5p24h后,和陰性對照組相比,測定microrna-30a-5p的表達量高出42.2倍。實時熒光定量rt-pcr結果顯示skov3/ddp細胞轉染inhibitor24h后microrna-30a-5p的△ct為8.9,陰性對照組△ct為5.6。轉染inhibitor24h后,和陰性對照組相比,測定microrna-30a-5p的表達量高出9.8倍(負相關),表明轉染成功。3microrna-30a-5p對skov3/ddp和skov3細胞耐藥性的影響:轉染pre-mir30a-5p后的skov3細胞增加了對順鉑的耐藥性。ic50為:3.5±0.26ug/ml;陰性對照組為:1.8±0.12ug/ml。兩者差異顯著(p0.05)。轉染inhibitor后的skov3/ddp細胞降低了對順鉑的耐藥性。ic50為:7.6±0.38ug/ml;陰性對照組為:13±0.47ug/ml。兩者差異顯著(p0.05)。4 microRNA-30a-5p對SKOV3/DDP和SKOV3水平產生的影響:轉染pre-mi R30a-5p 24h后,和陰性對照組相比,細胞接種的第2天起細胞水平明顯升高(P0.05),細胞的活性顯著上升。轉染inhibitor 24h后,和陰性對照組相比,細胞接種的第2天起細胞水平明顯下降(P0.05),細胞的活性顯著降低。結論:實時熒光定量RT-PCR的結果與細胞株基因芯片表達譜分析一致,microRNA-30a-5p在卵巢癌耐藥細胞中高表達,在化療耐藥型組織標本中也有較高的表達,提高microRNA-30a-5p的表達可以增加敏感細胞的耐藥性、提高細胞活性。故推測卵巢癌耐藥可能與microRNA-30a-5p的表達上調有關。設想是否將來臨床可以通過下調microRNA-30a-5p的表達進而逆轉卵巢癌細胞的耐藥,增加其對順鉑的敏感性。第三部分microRNA-30a-5p在卵巢癌耐藥細胞中的作用目的:通過上調或下調microRNA-30a-5p在卵巢癌敏感及耐藥細胞中的表達,檢測對卵巢癌細胞增殖、轉移能力及裸鼠呈瘤能力的影響,探討microRNA-30a-5p在卵巢癌細胞耐藥中的作用機制。方法:通過轉染pre-mi R30a-5p或者inhibitor,上調或下調敏感及耐藥細胞中microRNA-30a-5p的表達,通過測定細胞生長曲線實驗、集落形成實驗及體內裸鼠成瘤實驗來檢測其對細胞增殖能力的影響;通過transwell遷移和侵襲實驗來檢測其對細胞轉移能力的影響。結果:結果表明:轉染microRNA-30a-5p inhibitor進入卵巢癌耐藥細胞中,可以抑制細胞的增殖,減少細胞克隆形成和裸鼠成瘤能力并在體外減弱細胞的遷移和侵襲能力。而轉染pre-miR30a-5p進入卵巢癌親本株中,能促進細胞生長,促進形成細胞集落和裸鼠成瘤,提升體外細胞的侵襲及遷移作用。結論:microRNA-30a-5p能促進細胞生長、促進細胞集落形成和提高裸鼠成瘤能力,增強體外細胞遷移和侵襲能力。microRNA-30a-5p可能通過調節(jié)細胞生長及轉移機制影響卵巢癌細胞耐藥,為逆轉卵巢癌耐藥、改善卵巢癌預后提供了新的研究思路及靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 婁艷輝;楊興升;王福玲;錢金花;黃煜;;miR-21在上皮性卵巢癌組織中的表達及臨床意義[J];南方醫(yī)科大學學報;2010年03期

，

本文編號：1717741