本文選題：卵巢癌　切入點(diǎn)：順鉑耐藥　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：在女性常發(fā)的生殖器惡性腫瘤中卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率較高,其中85~90%為上皮性卵巢癌,對(duì)女性的身心健康造成了嚴(yán)重的威脅。病人的5年生存率處于30~40%的范圍內(nèi),由于早期的卵巢癌均沒(méi)有明顯的診斷指標(biāo),并且該疾病極易發(fā)生早期侵襲及轉(zhuǎn)移、病人對(duì)化療藥具有耐藥性,使其在女性所有惡性腫瘤中的死亡率排列第一。目前臨床上治療該病的規(guī)范化療法為聯(lián)合使用腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)與術(shù)后使用紫杉醇和鉑類等藥物化療,但鉑類藥物涉及的耐藥性問(wèn)題也值得關(guān)注。卵巢癌病人產(chǎn)生鉑類藥物耐藥性的過(guò)程需要多種因素相互作用,通過(guò)研究micro RNA一方面能夠從一定程度上闡述這種生物學(xué)效應(yīng),另一方面還有助于臨床上預(yù)測(cè)、或干涉耐藥性,microRNA除了能有效的調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、應(yīng)激、凋亡及脂肪代謝等作用,體外研究結(jié)果同樣表明在卵巢癌耐藥機(jī)制中microRNA扮演著重要的角色。本實(shí)驗(yàn)初步的探討了卵巢癌產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制,分析microRNA在該過(guò)程中扮演了重要的角色,以期為未來(lái)相關(guān)領(lǐng)域?qū)ふ也⒎治黾膊〉你K類耐藥性的治療靶點(diǎn)給予新的研究方向。microRNA主要存在于真核生物中,其包括的核苷酸數(shù)量約為20~25個(gè),此類非編碼小分子RNA能夠介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控其表達(dá)水平,廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程。超過(guò)50%的microRNA存在于腫瘤細(xì)胞基因組中變異性較高的部位,如雜合性丟失區(qū)、脆性位點(diǎn)和基因組斷裂點(diǎn)等,以上區(qū)域是癌細(xì)胞發(fā)生染色體轉(zhuǎn)位、替換、丟失、基因擴(kuò)增的主要部位。近幾年越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)micro RNA發(fā)揮著癌基因或抑癌基因樣作用,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、外侵轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)歸預(yù)后等多個(gè)環(huán)節(jié)。雖然,近幾年有大量的研究表明microRNA與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系,但卵巢癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今對(duì)卵巢癌早期診斷、治療和判斷預(yù)后仍然沒(méi)有特異性的指標(biāo)。本研究利用基因芯片和RT-PCR對(duì)耐藥和敏感卵巢癌細(xì)胞系中microRNA的表達(dá)譜進(jìn)行研究,尋找microRNA的差異表達(dá),進(jìn)一步研究差異表達(dá)顯著的microRNA在化療耐藥機(jī)制中的作用,為臨床逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥、提高卵巢癌治療效果奠定理論基礎(chǔ)。第一部分耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞系中microrna的差異表達(dá)目的:利用基因芯片研究?jī)山M卵巢癌細(xì)胞系skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1中microrna的表達(dá)譜,通過(guò)檢測(cè)耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)microrna的差異性,為未來(lái)相關(guān)領(lǐng)域?qū)ふ也⒎治雎殉舶┑你K類耐藥的治療靶點(diǎn)給予新的研究方向。方法:常規(guī)培養(yǎng)skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1細(xì)胞株,trizol法分別抽提總rna,對(duì)microrna分別進(jìn)行cy3和cy5熒光標(biāo)記,將所選細(xì)胞系與包含人類和小鼠的共924條microrna成熟的序列進(jìn)行雜交,最后進(jìn)行microrna微陣列芯片雜交檢測(cè)分析,獲得microrna表達(dá)譜,利用rt-pcr方法對(duì)篩選出的microrna進(jìn)行可靠性驗(yàn)證,鑒定出與卵巢癌耐藥相關(guān)的microrna。結(jié)果:1rna的質(zhì)量檢測(cè):從skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1細(xì)胞株提取出的總rna濃度值依次為:0.61、0.78、1.38及1.53(單位為μg/μl),a260/a280比值均處于1.9~2.0范圍內(nèi),瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,清晰的條帶包括18s及28s,其亮度比大概等于1:2,提取的總rna純度符合研究要求,未發(fā)生顯著的降解。2microrna芯片測(cè)定結(jié)果:本研究經(jīng)過(guò)cy3及cy5熒光顏色標(biāo)記、純化、基因芯片雜交、圖像采集、數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后,分別以兩種細(xì)胞cy3、cy5熒光標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度的比值為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定差異表達(dá)的microrna。結(jié)果顯示:其中skov3/dppvsskov3細(xì)胞系中hsa-mir-99a-5p,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-34c-5p,hsa-mir-31-3p,hsa-mir-181d等19個(gè)micrornas高表達(dá),hsa-mir-96-5p,hsa-mir-200c-3p,hsa-mir-193b-3p等20個(gè)micrornas低表達(dá)。coc1/dppvscoc1細(xì)胞系中hsa-mir-34a-5p,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-181c-3p等22個(gè)micrornas高表達(dá),hsa-mir-892b,hsa-mir-505-5p等24個(gè)micrornas低表達(dá)。其中hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-181在兩種耐藥卵巢癌細(xì)胞系中均表達(dá)升高。結(jié)論:在耐藥及敏感卵巢癌細(xì)胞系skov3/ddp和skov3,coc1/ddp和coc1中microrna的表達(dá)譜存在明顯差異。在所有差異表達(dá)的micrornas中,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-181在兩種化療耐藥卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)水平均高于敏感細(xì)胞系,推測(cè)二者可能是在microrna水平與卵巢癌化療耐藥相關(guān)的指標(biāo),而且利用rt-pcr方法對(duì)mir-30a-5p,hsa-mir-181在兩種化療耐藥卵巢癌細(xì)胞系中進(jìn)行可靠性驗(yàn)證,與基因芯片的結(jié)果一致,且以mir-30a-5p升高最為顯著。第二部分microrna-30a-5p對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞的影響目的:選擇敏感及耐藥卵巢癌細(xì)胞系中差異表達(dá)最顯著的microrna-30a-5p作為研究因子,探討microrna-30a-5p對(duì)卵巢癌細(xì)胞耐藥的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證microrna芯片篩選的結(jié)果。方法:常規(guī)培養(yǎng)skov3/ddp及skov3細(xì)胞系,實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr方法測(cè)定細(xì)胞系中microrna-30a-5p的表達(dá)情況,同時(shí)檢測(cè)卵巢癌敏感及耐藥組織標(biāo)本中microrna-30a-5p的表達(dá)情況。lipofectamin2000轉(zhuǎn)染microrna-30a-5ppre-mir、inhibitors至敏感及耐藥細(xì)胞中,通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,mtt法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果:1實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr方法測(cè)定細(xì)胞系和卵巢癌組織標(biāo)本中microrna-30a-5p的表達(dá)情況:microrna-30a-5p在耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)升高;在卵巢癌耐藥的組織標(biāo)本中表達(dá)也升高,結(jié)果與細(xì)胞株microrna芯片結(jié)果一致。2skov3/ddp和skov3細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后microrna-30a-5p的表達(dá)改變:實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr結(jié)果顯示skov3細(xì)胞轉(zhuǎn)染pre-mir30a-5p24h后microrna-30a-5p的△ct為2.3,陰性對(duì)照組△ct為7.7。轉(zhuǎn)染pre-mir30a-5p24h后,和陰性對(duì)照組相比,測(cè)定microrna-30a-5p的表達(dá)量高出42.2倍。實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr結(jié)果顯示skov3/ddp細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor24h后microrna-30a-5p的△ct為8.9,陰性對(duì)照組△ct為5.6。轉(zhuǎn)染inhibitor24h后,和陰性對(duì)照組相比,測(cè)定microrna-30a-5p的表達(dá)量高出9.8倍(負(fù)相關(guān)),表明轉(zhuǎn)染成功。3microrna-30a-5p對(duì)skov3/ddp和skov3細(xì)胞耐藥性的影響:轉(zhuǎn)染pre-mir30a-5p后的skov3細(xì)胞增加了對(duì)順鉑的耐藥性。ic50為:3.5±0.26ug/ml;陰性對(duì)照組為:1.8±0.12ug/ml。兩者差異顯著(p0.05)。轉(zhuǎn)染inhibitor后的skov3/ddp細(xì)胞降低了對(duì)順鉑的耐藥性。ic50為:7.6±0.38ug/ml;陰性對(duì)照組為:13±0.47ug/ml。兩者差異顯著(p0.05)。4 microRNA-30a-5p對(duì)SKOV3/DDP和SKOV3水平產(chǎn)生的影響:轉(zhuǎn)染pre-mi R30a-5p 24h后,和陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞接種的第2天起細(xì)胞水平明顯升高(P0.05),細(xì)胞的活性顯著上升。轉(zhuǎn)染inhibitor 24h后,和陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞接種的第2天起細(xì)胞水平明顯下降(P0.05),細(xì)胞的活性顯著降低。結(jié)論:實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的結(jié)果與細(xì)胞株基因芯片表達(dá)譜分析一致,microRNA-30a-5p在卵巢癌耐藥細(xì)胞中高表達(dá),在化療耐藥型組織標(biāo)本中也有較高的表達(dá),提高microRNA-30a-5p的表達(dá)可以增加敏感細(xì)胞的耐藥性、提高細(xì)胞活性。故推測(cè)卵巢癌耐藥可能與microRNA-30a-5p的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。設(shè)想是否將來(lái)臨床可以通過(guò)下調(diào)microRNA-30a-5p的表達(dá)進(jìn)而逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞的耐藥,增加其對(duì)順鉑的敏感性。第三部分microRNA-30a-5p在卵巢癌耐藥細(xì)胞中的作用目的:通過(guò)上調(diào)或下調(diào)microRNA-30a-5p在卵巢癌敏感及耐藥細(xì)胞中的表達(dá),檢測(cè)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力及裸鼠呈瘤能力的影響,探討microRNA-30a-5p在卵巢癌細(xì)胞耐藥中的作用機(jī)制。方法:通過(guò)轉(zhuǎn)染pre-mi R30a-5p或者inhibitor,上調(diào)或下調(diào)敏感及耐藥細(xì)胞中microRNA-30a-5p的表達(dá),通過(guò)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;通過(guò)transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果:結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染microRNA-30a-5p inhibitor進(jìn)入卵巢癌耐藥細(xì)胞中,可以抑制細(xì)胞的增殖,減少細(xì)胞克隆形成和裸鼠成瘤能力并在體外減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。而轉(zhuǎn)染pre-miR30a-5p進(jìn)入卵巢癌親本株中,能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)形成細(xì)胞集落和裸鼠成瘤,提升體外細(xì)胞的侵襲及遷移作用。結(jié)論:microRNA-30a-5p能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞集落形成和提高裸鼠成瘤能力,增強(qiáng)體外細(xì)胞遷移和侵襲能力。microRNA-30a-5p可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移機(jī)制影響卵巢癌細(xì)胞耐藥,為逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥、改善卵巢癌預(yù)后提供了新的研究思路及靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 婁艷輝;楊興升;王福玲;錢金花;黃煜;;miR-21在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年03期

，

本文編號(hào)：1717741