本文選題：卵巢癌　切入點：靶向治療　出處：《復旦大學》2014年博士論文

【摘要】：卵巢癌的死亡率高居婦女癌癥死亡率的前五位,并居婦科惡性腫瘤的首位。大多數(shù)卵巢癌患者在診斷時已處于晚期,而晚期卵巢癌的治療一直是一個很棘手的問題。盡管手術的改進、新藥物的上市、新化療方案的推出在一定程度上提高治療效果,但5年生存率仍未見明顯提高。化療是晚期卵巢癌治療的重要手段,但是多數(shù)晚期患者在治療后復發(fā)或耐藥,導致治療失敗。因此,有必要從卵巢癌發(fā)生發(fā)展機制和所處的激素環(huán)境出發(fā),探尋新的治療手段。我們課題組的前期工作表明,基于卵巢癌生理病理特征,以及卵巢組織所處的激素環(huán)境選擇特定的靶向位點,有可能獲得更為高效的治療效果和更低的毒副反應。卵巢是下丘腦-垂體激素的靶器官,因此,由這些激素受體介導的靶向藥物,相較其他靶標,在卵巢癌治療中可能更具優(yōu)勢。其中,卵泡刺激素受體(Follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)在人體中的分布比較局限,大多集中在生殖系統(tǒng),而且在人卵巢癌組織中亦有50%到60%的表達。我們課題組的前期研究表明,FSHR結合片段對納米材料的修飾能夠有效提高其對所包載的化療藥物或基因藥物的特異性遞送能力,FSHR是一種較為適宜的卵巢癌治療靶位點。MUC16是CA125的編碼基因,在卵巢癌組織和細胞中呈高表達,基于CA125在卵巢癌中的高表達,我們考慮可以利用CA125的編碼基因MUC16的啟動子作為第二重靶向,來指導靶向系統(tǒng)中目的基因在卵巢癌細胞中的表達。結合我們課題組前期研究,可以將MUC16啟動子引入shRNA質粒,來調控質粒中shRNA的表達,從而特異性下調MUC16陽性卵巢癌細胞中目的基因的表達。同時,在包載質粒的納米材料表面修飾以FSHR結合片段,通過FSHR受體介導的靶向和MUC16啟動子的調控實現(xiàn)雙重靶向。因此,本文選擇FSHR的多肽結合片段作為靶向頭基,構建主動靶向卵巢癌的遞藥系統(tǒng)。為了進一步提高靶向性,在遞藥系統(tǒng)中引入了MUC16啟動子對下游基因進行調控�，F(xiàn)在認為,對于腫瘤細胞,基質除了單純的支持和營養(yǎng)作用以外,還參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉移。其中,成纖維細胞作為基質的主要成分,在癌變細胞和基質細胞的交互作用中扮演了主要角色。也已證實,腫瘤基質中的成纖維細胞在形態(tài)和功能上均不同于正�；|,它能夠促進細胞的惡性轉化,且與腫瘤的增殖、浸潤和轉移密切相關。本課題組在前期工作中也證實約83%的人卵巢癌組織中存在gro-a的高表達。因此,抑制gro-a表達或拮抗其功能的策略,不失成為干預腫瘤基質的有效策略。而干預腫瘤基質和抑制腫瘤細胞的雙管齊下,定可提高抗腫瘤療效。生長調節(jié)性癌基因a (Growth-regulated oncogene alpha, Gro-a)是細胞惡性轉化過程中的關鍵元件,在卵巢癌組織與細胞中高表達,與卵巢癌的增殖,浸潤及轉移密切相關。為了對我們所構建的遞藥系統(tǒng)進行驗證,選擇gro-a的shRNA作為模型藥物,對靶向復合物的體內外療效進行考察。在第一部分中,我們采用免疫細胞化學、Western Blot、ELISA和實時定量PCR檢測人卵巢癌細胞中FSHR、MUC16及gro-a的表達。結果提示人卵巢癌細胞系HEY高表達FSHR、MUC16及gro-a,因此我們將HEY細胞用于后續(xù)實驗。而人卵巢癌細胞SKOV3低表達或不表達FSHR,同時又表達MUC16及Gro-a,因此我們將SKOV3細胞用作實驗對照。在第二部分中,設計合成4條針對gro-a基因的shRNA序列,采用流式細胞儀及熒光顯微鏡檢測不同序列對人卵巢癌細胞的轉染效率。采用ELISA、 Western Blot口實時定量PCR檢測不同序列對目的基因的下調情況,篩選出高效的gro-a shRNA序列。結果提示shRNA序列4較其他序列具有更強的沉默效果,因此我們選用此序列進行后續(xù)實驗。在第三部分中,通過生物信息學方法預測得到4條可能有效的MUC16啟動子序列,然后采用雙熒光報告基因的方法對其進行啟動子活性檢測,獲得活性較好的序列,并構建MUC16啟動子調控的gro-a shRNA質粒。結果提示,啟動子序列1和2在MUC16陽性的人卵巢癌細胞系HEY中具有較高的啟動活性,因此我們將這2條序列用于質粒構建。在第四部分中,采用α-琥珀酰亞胺基-ω-丙基馬來酰亞胺基-聚乙二醇和支鏈狀聚乙烯亞胺制備不同配比的復合物,修飾以FSHR結合片段,并與有或無MUC16啟動子調控的質粒DNA連接,制備靶向復合物。采用電鏡、1H-NMR、粒徑/Zeta電位儀和凝膠阻滯電泳實驗對納米復合物進行表征檢測。結果顯示,隨著N/P比的增大,粒徑逐漸縮小,Zeta電位也由負電荷向正電荷增加。當N/P比為10時,即可達到100%包封。當N/P比為25時,2%PEG接枝量的靶向復合物粒徑約為(142.0±3.8)nm,Zeta電位約為(24.1±2.4)mV；非靶向復合物粒徑約為(123.8±6.0)nm,Zeta電位約為(37.7±3.6)mV; 5%PEG接枝量的靶向復合物粒徑約為(168.0±4)nm,Zeta電位約為(25.1±3.4)mV；非靶向復合物粒徑約為(125.0±4.5)nm,Zeta電位約為(35.7±4.6) mV; FSH多肽修飾MUC16啟動子調控的雙靶向復合物粒徑約為(186.0±4.5)nm；Zeta電位約為(30.0±2.3)mV；非FSH多肽修飾的MUC16啟動子調控的雙靶向復合物粒徑約為(170.0±4.1)nm,Zeta電位為(33.0±3.3)mV。在第五部分中,采用ELISA、Western Blot和實時定量PCR檢測靶向復合物對目的基因gro-a的下調效果,考察其靶向性。結果表明,PEG接枝量為2%或5%時,FSHR結合片段修飾的納米復合物均可顯著下調FSHR陽性卵巢癌細胞中gro-a的表達。當在遞藥系統(tǒng)中引入MUC16啟動子調控后,gro-a在MUC16陽性卵巢癌細胞中的表達同樣能夠被下調。提示FSHR介導的靶向或是MUC16啟動子調控的靶向均能夠增強遞藥系統(tǒng)所攜帶的shRNA對細胞中目的基因的下調效應,可能是由于靶向基團在納米材料的基礎上進一步促進了藥物進入細胞的能力所致。在第六部分中,采用細胞增殖實驗以及transwell穿膜實驗檢測靶向復合物對卵巢癌細胞惡性生物學行為的影響。結果提示,FSH多肽修飾的納米復合物能夠明顯抑制FSHR陽性的卵巢癌細胞HEY的增殖、侵襲和遷移能力。當引入MUC16啟動子調控作為第二重靶向后,納米復合物對細胞惡性生物學行為的抑制效應明顯增強,其中以MUC16啟動子序列1更為明顯。此外,本部分結果提示FSH多肽修飾可在PEG的基礎上一步降低納米復合物自身的毒性,增加了體內應用的可行性。在第七部分中,利用人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,對靶向復合物的體內藥效和安全性進行了初步評價。結果表明,有FSH多肽修飾的2%PEG接枝量靶向復合物能夠明顯抑制腫瘤生長,同時延長荷瘤裸鼠的生存時間,而無FSH多肽修飾的復合物在給藥后第二天,70%的荷瘤裸鼠因急性毒性而死亡。將PEG的比例提升到5%后,各組裸鼠未出現(xiàn)明顯的毒副反應。與其他組相比,FSH多肽修飾的靶向復合物對裸鼠瘤體生長的抑制作用最強,抑瘤率約為75.28%。實驗結束后對荷瘤裸鼠的瘤體進行檢測,結果提示FSH多肽修飾的納米復合物能夠下調腫瘤組織中目的基因gro-a mRNA及蛋白的表達水平。本文研制了FSH多肽修飾的靶向遞藥系統(tǒng),并進行了配比優(yōu)化,同時在此基礎上引入了MUC16啟動子作為第二重靶向調控。為了評價遞藥系統(tǒng)的作用價值,選擇在卵巢癌細胞和基質細胞的交互對話中有重要作用的gro-a的小干擾RNA作為模型藥物,考察靶向復合藥物的療效。FSH多肽修飾的靶向遞藥系統(tǒng),當靶向沉默在卵巢癌細胞和基質細胞的交互對話中有重要作用的gro-a后,卵巢癌的生長受到顯著抑制。同時,本研究結果提示,FSHR介導的主動靶向修飾能夠降低納米材料的毒性,增加了將其用于體內實驗研究的可行性。這一研究再次證實我們提出的基于婦科腫瘤病理生理特點,篩選藥物導向靶點,以此建立高效靶向治療技術的思路是正確的,并為其他腫瘤的靶向治療研究提供了可借鑒的方法。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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2 盧實;蔡俐瓊;王曉翊;王澤華;;mdr1啟動子調控CD∷UPP基因對紫杉醇耐藥卵巢癌細胞的殺傷作用[J];腫瘤;2007年07期

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本文編號：1706755