本文選題：高危型人乳頭狀瘤病毒　切入點(diǎn)：陰道菌群　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景宮頸癌是威脅全世界女性健康最為嚴(yán)重的疾病之一,其發(fā)病率和死亡率均居女性生殖道惡性腫瘤的首位。目前研究已經(jīng)證實(shí),高危型人乳頭瘤病毒(High-risk human papillomavirus, HR-HPV)的持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia, CIN)及宮頸癌發(fā)生的必要條件。當(dāng)陰道感染HPV病毒后,大多數(shù)女性的陰道微環(huán)境可以自行將病毒清除。只有少數(shù)女性的HPV病毒可以長(zhǎng)時(shí)間存在于陰道微環(huán)境中,經(jīng)過(guò)5-10年的時(shí)間,最終發(fā)展為CIN及癌變。因此,在這個(gè)過(guò)程中可能還有其它致癌因素或協(xié)同HPV作用的因素存在,導(dǎo)致宮頸感染HPV的易感性增加,HPV感染得以持續(xù)存在,最終導(dǎo)致癌變發(fā)生。陰道菌群作為維護(hù)陰道微環(huán)境穩(wěn)定的重要因素,其在HR-HPV持續(xù)感染過(guò)程中是否扮演一定作用一直被人們所關(guān)注,不同研究的結(jié)果也不盡相同。陰道微生物研究的關(guān)鍵在于陰道菌群的鑒定,早期的研究主要建立在傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上。女性的生殖道是一個(gè)相對(duì)密閉的環(huán)境,陰道微生物以厭氧菌為主,培養(yǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)需求要求嚴(yán)苛,導(dǎo)致目前很大一部分細(xì)菌仍然無(wú)法分離培養(yǎng)及鑒定,因此使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)依賴方法難以全面的認(rèn)識(shí)陰道微生物的群落結(jié)構(gòu)。近年來(lái),隨著非培養(yǎng)依賴的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步,如熒光原位雜交、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等,使人們對(duì)陰道菌群的認(rèn)識(shí)取得了突破性進(jìn)展。但是這些較傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)仍然具有其局限性,不僅研究工作量大、所需時(shí)間長(zhǎng),且不能完整的反映整個(gè)微環(huán)境中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)信息,甚至存在重要信息缺失的可能。Barcoded Paired-End Illumina Sequencing (BIPES)法是基于Illumina Solexa高通量測(cè)序平臺(tái),結(jié)合16S rRNA標(biāo)簽序列分析微生物群落的新一代測(cè)序方法,具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、重現(xiàn)性好等諸多優(yōu)點(diǎn),能簡(jiǎn)便、快捷的獲得系統(tǒng)的、結(jié)構(gòu)化的、全面的菌群信息。本研究利用這一新的測(cè)序方法,對(duì)HR-HPV感染女性和健康女性的陰道菌群進(jìn)行檢測(cè),更加準(zhǔn)確及全面的認(rèn)識(shí)HR-HPV感染女性與健康女性陰道菌群物種多樣性和群落結(jié)構(gòu),探討HR-HPV感染與陰道菌群之間的關(guān)系。同時(shí),通過(guò)對(duì)不同級(jí)別宮頸病變女性的陰道菌群進(jìn)行分析,了解不同級(jí)別宮頸病變女性陰道微生物的分布特征、群落結(jié)構(gòu)及宮頸病變發(fā)生發(fā)展中各微生物種群的動(dòng)態(tài)變化,以期為進(jìn)一步研究宮頸病變的病因、發(fā)生發(fā)展過(guò)程中陰道微生態(tài)療法及益生菌制劑的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。研究目的1.借助Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)及BIPES的序列研究方法,分析HR-HPV感染女性和健康女性陰道微生物的菌群構(gòu)成及其多樣性,比較HR-HPV感染女性和健康女性陰道菌群的差異,探索HR-HPV感染與陰道菌群的關(guān)系。2.通過(guò)對(duì)不同級(jí)別宮頸病變女性的陰道菌群進(jìn)行分析,了解宮頸病變不同階段的陰道微生物分布特征及群落結(jié)構(gòu),追蹤宮頸病變發(fā)生發(fā)展過(guò)程中各微生物種群的動(dòng)態(tài)變化,探尋陰道菌群的動(dòng)態(tài)變化與宮頸病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。研究方法第一章：1.研究對(duì)象選取2014年9月至2015年9月間于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科健康體檢或診治的女性,根據(jù)HR-HPV篩查(hC2法)結(jié)果分為2組：①HPV陰性組(HPV-組)33例：均為健康體檢者,HR-HPV檢查均陰性；②HPV陽(yáng)性組(HPV+組)98例：HR-HPV均陽(yáng)性。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡21-65歲；有性生活史3年及以上；非月經(jīng)期、妊娠期及產(chǎn)褥期婦女。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡65歲；無(wú)性生活史者；合并免疫缺陷疾病者；合并全身系統(tǒng)性疾病者：糖尿病、激素治療性疾病(急慢性腎炎等)等。同時(shí)需滿足以下條件：48 h內(nèi)無(wú)陰道沖洗；3d內(nèi)無(wú)性生活史、陰道放藥史；1個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)性使用抗生素或抗真菌藥。2.標(biāo)本采集：以無(wú)菌棉拭子于陰道穹窿或陰道中段側(cè)壁處留取分泌物,用于16S rRNA基因提取。3.總DNA提�。翰捎藐幍朗米踊蚪MDNA試劑盒提取樣本總DNA,具體步驟參考說(shuō)明書。DNA提取后置于-20℃冰箱保存。4.16S rRNA-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增及Illumina測(cè)序：以提取的DNA為模板,擴(kuò)增其16S rRNA V4區(qū)的基因片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及紫外熒光定量后,以相等的終濃度將PCR產(chǎn)物混合均勻,送至深圳華大基因進(jìn)行雙末端100bp測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq2000。5.對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)以BIPES程序進(jìn)行預(yù)處理。通過(guò)兩階段聚類(Two-stage-clustering, TSC)的分析方法提取出每個(gè)操作分類單元(operational taxonomy units, OTU)的代表序列,然后再利用GAST對(duì)OTU進(jìn)行歸類,用于樣品間的相似性分析,主要包括Alpha多樣性、Beta多樣性及菌群結(jié)構(gòu)分析。通過(guò)linear discriminant analysis (LDA) coupled with effect size measurements (LEfSe)在線分析工具分析兩組間陰道菌群群落結(jié)構(gòu)及菌屬差異。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組計(jì)量資料間的比較采用兩獨(dú)立樣品的t檢驗(yàn),對(duì)多樣性指數(shù)應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第二章1.研究對(duì)象選取2014年9月至2015年9月間于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科健康體檢或診治的女性,根據(jù)宮頸液基細(xì)胞學(xué)、HR-HPV篩查(hC2法)和宮頸活檢病理結(jié)果分為4組：①正常組(N組)33例：均為健康體檢者,宮頸細(xì)胞學(xué)及HR-HPV檢查均陰性；②低級(jí)別組(L組)26例：HR-HPV檢查陽(yáng)性；和／或?qū)m頸活組織檢查確診為低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變；③高級(jí)別組(H組)40例：HR-HPV檢查陽(yáng)性,宮頸活組織檢查確診為高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變；④宮頸癌組(C組)32例：HR-HPV檢查陽(yáng)性,宮頸活組織檢查確診為宮頸癌。納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)與“第一章”相同。標(biāo)本采集、總DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物測(cè)序和數(shù)據(jù)處理與“第一章”相同。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)多組間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)、LSD兩兩檢驗(yàn),余與“第一章”相同。研究結(jié)果實(shí)驗(yàn)一1.本實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣品數(shù)131個(gè),共獲得971007條序列,平均每個(gè)樣品7412條。2.采用PD_whole_tree (PD)和Shannon兩個(gè)多樣性指數(shù)來(lái)比較HPV-組和HPV+組陰道菌群Alpha多樣性的差異。結(jié)果顯示HPV+組的PD指數(shù)和Shannon指數(shù)均增高,且兩組間Shannon指數(shù)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。3.在菌屬水平上,HPV-組以乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬,占81.54%。HPV+組的菌群結(jié)構(gòu)呈多樣性改變,乳酸桿菌屬含量顯著下降,僅占40.48%,同時(shí)加德納菌屬相對(duì)豐度顯著增加,由3.01%增加至19.87%。普氏菌屬、奇異菌屬、消化鏈球菌屬等多種厭氧菌屬和脲原體屬、支原體屬相對(duì)豐度也增加。4.利用QIIME軟件進(jìn)行兩組間的Beta多樣性分析顯示,兩組陰道微生物的總體菌群結(jié)構(gòu)在Weighted_unifrac距離的聚類結(jié)果可顯著的區(qū)分為2個(gè)不同的部分。5.通過(guò)LEfSe分析兩組間差異菌屬發(fā)現(xiàn),乳酸桿菌屬在HPV-組中富集,而加德納菌屬、普氏菌屬、奇異菌屬、厭氧球菌屬、擬桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬等厭氧菌屬在陽(yáng)性組中富集,且于HPV+組中檢測(cè)到布魯氏菌屬的存在。實(shí)驗(yàn)二1.本實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣品數(shù)131個(gè),共獲得971007條序列,平均每個(gè)樣品7412條。2.采用PD_whole_tree (PD)和Shannon兩個(gè)多樣性指數(shù)對(duì)四組陰道菌群的Alpha多樣性進(jìn)行分析。隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展,陰道微生物的Alpha多樣性逐漸增加,菌群的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,且于宮頸癌組患者中陰道微生態(tài)改變達(dá)最大化。3.在屬水平上,隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展,乳酸桿菌屬相對(duì)豐度逐漸下降；加德納菌屬的比例先驟增而后逐漸降低；大量低豐度、未知菌屬的含量逐漸增加；多種厭氧菌屬所占比例也有不同程度的增加。4.通過(guò)LEfSe進(jìn)行各組間差異菌屬分析發(fā)現(xiàn),加德納菌屬、支原體屬、脲原體屬主要在低級(jí)別組富集,高級(jí)別組和宮頸癌組主要富集多種厭氧菌屬。5.四組陰道菌群的總體結(jié)構(gòu)在Weighted_unifrac距離的聚類結(jié)果有差異。隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展,與正常組的距離逐漸拉開(kāi),直至顯著的區(qū)分為2個(gè)不同的部分。相鄰兩組間的陰道微生物存在某些相似的菌群構(gòu)成,但同時(shí)具有相互分開(kāi)的趨勢(shì)。研究結(jié)論1.健康女性的陰道菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)單一,HR-HPV感染女性陰道菌群多樣性增加,提示陰道菌群失調(diào)與HR-HPV感染之間存在相關(guān)性。2.隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展,陰道菌群結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)乳酸桿菌屬逐漸減少,物種多樣性逐漸增加的趨勢(shì)。3.陰道菌群中乳酸桿菌屬的減少和／或布魯氏菌屬的出現(xiàn)可能是導(dǎo)致HR-HPV持續(xù)存在并致瘤的原因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：1705062