發(fā)布時間：2018-04-02 06:47

  本文選題：Twist2　切入點(diǎn)：miR-221　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景和目的 宮頸癌是婦女生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。近年國外報道在普通人群中宮頸癌的發(fā)病率有所下降,但在發(fā)展中國家尤其在我國,由于HPV感染增多、篩查程序的混亂等,宮頸癌的發(fā)病率和死亡率反而增加并有年輕化傾向。雖然篩查和手術(shù)聯(lián)合綜合治療的防治模式已有效改善早期宮頸癌的預(yù)后,但轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的宮頸癌卻很難達(dá)到徹底根治,也是患者死亡的主要危險因素。因而,加強(qiáng)宮頸癌侵襲進(jìn)展機(jī)制的基礎(chǔ)研究,闡明宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,對宮頸癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期預(yù)測、診斷和預(yù)后評估及對于提高宮頸癌治愈率,降低死亡率具有重要科學(xué)意義,文獻(xiàn)報道人類癌癥中存在miRNAs的異常表達(dá),50%以上的人類miRNAs位于腫瘤相關(guān)基因區(qū)域,例如脆性位點(diǎn)、雜合子丟失區(qū)或靠近癌基因、抑癌基因的部位,易于發(fā)生缺失、擴(kuò)增或轉(zhuǎn)位等。因此,,miRNAs可能通過靶向調(diào)控特定的癌基因或抑癌基因而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。同時,miRNAs還受上游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,這樣從上到下構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,miRNAs與宮頸癌關(guān)系的報道近年來逐漸增多,在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的過程中具有重要作用。 本文利用miRNA芯片在穩(wěn)定細(xì)胞株中(siha-twist2及siha-shtwist2)篩選出與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移因子twist2密切相關(guān)的niRNA221,明確其在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。本文的研究目的如下： 1.宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA的篩選及驗證； 2.miR221通過靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信號通路在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用； 3.miR221與上游轉(zhuǎn)錄因子twist2之間作用的鑒定。 研究方法 1.宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)niRNA的篩選及功能驗證 1.1利用穩(wěn)篩細(xì)胞株(siha-twist2及siha-shtwist2)及miRNA芯片篩選與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移因子twist2相關(guān)的miRNA并通過熒光定量PCR法(qPCR)驗證芯片結(jié)果。 1.2利用qPCR、westernblot、劃痕實(shí)驗及Borden侵襲小室實(shí)驗對miRNA221在宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移行為中的作用進(jìn)行驗證。 2. miR221通過靶基因ARID1A及wnt/p-catenin信號通路在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用 2.1選取10個常用的miRNA靶基因預(yù)測軟件DIANAmT、miRanda、miRDB、 miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、Targetscan對miRNA221的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測；利用NIAID/NIH提供的DAVID6.7分析平臺并結(jié)合Biocarta pathway和KEGG pathway軟件對miR-221的下游靶基因進(jìn)行了功能聚類及信號通路分析。 2.2利用westernblot、載體構(gòu)建及雙熒光素酶報告分析實(shí)驗對miRNA221下游靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控進(jìn)行驗證。 3.miR221與上游轉(zhuǎn)錄因子twist2之間作用的鑒定 3.1利用qPCR、westernblot、劃痕實(shí)驗及Borden侵襲小室實(shí)驗對上游轉(zhuǎn)錄因子twist2調(diào)控niRNA221誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移行為進(jìn)行探討。 3.2利用載體構(gòu)建及雙熒光素酶報告分析實(shí)驗對miRNA221與上游轉(zhuǎn)錄因子twist2之間直接作用進(jìn)行驗證。 研究結(jié)果 1.宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA的篩選及功能驗證 1.1宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA的篩選 利用配對細(xì)胞株siha、siha-tw2、siha-shtw2送檢芯片,結(jié)果提示8個差異性表達(dá)最明顯的1nicroRNA,其中包括miRNA221;利用實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)在配對細(xì)胞株中檢測差異表達(dá)明顯的microRNA,對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證,2-△△CT值通過單因素方差分析結(jié)果顯示：miRNA221差異性表達(dá)明顯(F=64.64,P0.001),進(jìn)一步在宮頸癌組織中檢測miRNA221的表達(dá),發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中miRNA221的表達(dá)與twist2的表達(dá)呈正相關(guān),與芯片結(jié)果相符(F0.70,F=24.75,P0.001)。 1.2miR221對宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響 (1)利用qPCR檢測宮頸癌細(xì)胞株siha、siha-nc(m)、siha-nc(i)、siha-m、siha-i中miR221及EMT相關(guān)標(biāo)記物(E-CAD、N-CAD、Vimentin)的表達(dá),以siha組為對照,經(jīng)單因素方差分析檢測,結(jié)果顯示五組間E-CAD、N-CAD、Vimentin的表達(dá)具有顯著差異(F=34.1,P0.001;F=27.026,P0.001;F=17,P0.001);對5組間進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果顯示,miR-221在siha-m中的表達(dá)明顯高于siha及siha-nc(m)組,且EMT相關(guān)標(biāo)記物E-CAD表達(dá)明顯降低,而N-CAD及Vimentin表達(dá)明顯上升；miR-221在siha-i中的表達(dá)明顯低于siha及siha-nc(i)組,EMT相關(guān)標(biāo)記物E-CAD表達(dá)明顯升高,而N-CAD及Vimentin表達(dá)明顯下降。 (2)利用westemblot檢測宮頸癌細(xì)胞株siha、siha-nc(m)、siha-nc(i)、siha-m、 siha-i中EMT相關(guān)標(biāo)記物(E-CAD、N-CAD、Vimentin)的表達(dá),結(jié)果顯示,在宮頸癌siha細(xì)胞中,E-CAD在過表達(dá)niR221組siha-m中的表達(dá)明顯低于siha及siha-nc(m),而N-CAD及Vimentin的表達(dá)明顯增高；相反,E-CAD在沉默miR-221組siha-i的表達(dá)明顯增高,而N-CAD及Vimentin的表達(dá)明顯降低。 (3)利用劃痕實(shí)驗檢測宮頸癌細(xì)胞株siha、siha-nc(m)、siha-nc(i)、siha-m、 siha-i不同組中宮頸癌細(xì)胞的遷移能力,結(jié)果顯示,siha-m組的細(xì)胞遷移能力明顯高于siha、siha-nc(m)組,而siha-i組的細(xì)胞遷移能力明顯低于siha、siha-nc(i)。 (4)利用Borden侵襲小室檢測宮頸癌細(xì)胞株siha、siha-nc(m)、siha-nc(i)、 siha-m、siha-i不同組之間細(xì)胞的體外侵襲能力變化,統(tǒng)計結(jié)果顯示,5組之間細(xì)胞的侵襲能力具有顯著性差異。且siha-m組細(xì)胞穿膜數(shù)目比siha、siha-nc(m)顯著增多,而siha-i組細(xì)胞穿膜數(shù)目比siha、siha-nc(i)顯著減少。 2.miR221通過靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信號通路在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用 2.1miR221下游靶基因及信號通路的預(yù)測 (1)miR221下游靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測 選取10個常用的niRNA靶基因預(yù)測軟件DIANAmT、miRanda、miRDB、 miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、Targetscan對miR-221的靶基因進(jìn)行預(yù)測,ARID1A基因的預(yù)測值最高,于是我們選擇ARID1A作為miR-221的靶基因。并對靶基因ARID1A進(jìn)行實(shí)驗鑒定。 (2)MiR221下游信號通路的生物信息學(xué)預(yù)測 利用NIAID/NIH提供的DAVID6.7分析平臺并結(jié)合Biocarta pathway和KEGG pathway軟件對miR-221的下游靶基因進(jìn)行了功能聚類及信號通路分析,結(jié)果顯示wnt/β-catenin信號通路的預(yù)測頻率最高。 2.2miR221對下游靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控 (1)利用westernblot檢測宮頸癌細(xì)胞株siha不同處理組siha、siha-nc(m)、 siha-nc(i)、siha-m、siha-i中ARID1A及磷酸化β-catenin的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,siha-m組中ARID1A的表達(dá)明顯低于siha及siha-nc(m)組；而siha-i組中ARID1A的表達(dá)明顯高于siha及siha-nc(i)組；siha-m組中磷酸化β-catenin的表達(dá)明顯低于siha及siha-nc(m)組,而siha-i組與siha、siha-nc(i)組之間磷酸化P-catenin的表達(dá)無明顯差異。 (2)在宮頸癌細(xì)胞株siha中,轉(zhuǎn)染構(gòu)建質(zhì)粒pscicheck2/ARID1A及miR221mimic,對siha(blank)、miR221NC-lu、miR221mi-luc三組利用雙熒光素酶報告分析方法檢測各組細(xì)胞中熒光素酶活性,結(jié)果顯示,同時轉(zhuǎn)染了pscicheck2/ARID1A及miR221mimic的miR221mi-luc組的熒光素酶活性明顯低于blan、miR221NC-luc組(=635.4,P0.001),blank及miR221NC-luc組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。 3.miR221與上游轉(zhuǎn)錄因子twist2之間作用的鑒定 3.1twist2對miR221促進(jìn)宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移行為的調(diào)控 (1)利用qPCR檢測宮頸癌細(xì)胞株siha、sihatw2、sihashtw2、sihatw2i、 sihashtw2-m中EMT相關(guān)標(biāo)記物(E-CAD、N-CAD、Vimentin)的表達(dá),以siha組為對照,經(jīng)單因素方差分析檢測,結(jié)果顯示五組間E-CAD、N-CAD、Vimentin的表達(dá)具有顯著差異(F=221.991,P0.001;F=369.073,P0.001;F=404.261,P0.001)；對5組間進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果顯示,E-CAD在sihatw2-i(轉(zhuǎn)染了miR221inhibitor)中的表達(dá)明顯高于sihatw2組,而N-CAD及Vimentin表達(dá)明顯下降；E-CAD在sihashtw2-m(轉(zhuǎn)染了miR221mimic)中的表達(dá)明顯低于sihashtw2組,而N-CAD及Vimentin表達(dá)明顯上升。 (2)利用westernblot檢測宮頸癌細(xì)胞株siha、sihatw2、sihashtw2、sihatw2-i、 sihashtw2-m中EMT相關(guān)標(biāo)記物(E-CAD、N-CAD、Vimentin)的表達(dá),結(jié)果提示：E-CAD在過表達(dá)miR221組sihashtw2-m中的表達(dá)明顯低于sihashtw2,而N-CAD及Vimentin的表達(dá)明顯增高；相反,E-CAD在沉默miR-221組sihatw2-i的表達(dá)較siha及sihatw2明顯增高,而N-CAD及Vimentin的表達(dá)明顯降低。 (3)利用劃痕實(shí)驗檢測宮頸癌細(xì)胞株siha、sihatw2、sihashtw2、sihatw2-i、sihashtw2-m不同組中宮頸癌細(xì)胞的遷移能力,結(jié)果顯示,sihashtw2-m組的細(xì)胞遷移能力明顯高于sihashtw2組,而sihatw2-i組的細(xì)胞遷移能力明顯低于sihatw2。 (4)利用Borden侵襲小室檢測宮頸癌細(xì)胞株siha、sihatw2、sihashtw2、sihatw2-i、 sihashtw2-m不同組之間細(xì)胞的體外侵襲能力變化,統(tǒng)計結(jié)果顯示,5組之間細(xì)胞的侵襲能力具有顯著性差異。且sihashtw2-m組細(xì)胞穿膜數(shù)目比sihashtw2顯著增多,而sihatw2-i組細(xì)胞穿膜數(shù)目比sihatw2顯著減少。 3.2twist2與miR221直接作用的驗證 (1)通過Ensembl數(shù)據(jù)庫,在線獲得編碼miR221序列上游2kb作為miR-221的啟動子序列。 (2)利用三種在線軟件(Mapper2,Consite及TRED)預(yù)測及分析可能與miR-221啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,并結(jié)合前期關(guān)于宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究,確定twist2作為miR-221的轉(zhuǎn)錄因子。 (3)利用雙熒光素酶報告基因檢測miR221啟動子和轉(zhuǎn)錄因子twist2之間的熒光素酶活性,結(jié)果顯示,當(dāng)共同轉(zhuǎn)染PGL3-basic/221和pcDNA3.1/tw2時,共同轉(zhuǎn)染組(tw2+PGL3-221)較單獨(dú)轉(zhuǎn)染PGL3-221組及blank組熒光素酶活性顯著增強(qiáng),表明twist2能明顯促進(jìn)miR-221啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(F=130,P0.001)。 結(jié)論 1、成功篩選出與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移因子twist2相關(guān)的8個miRNA,通過在細(xì)胞株siha、siha-tw2、siha-shtw2中驗證得出miR221、miR221*、miR502-3p的差異性表達(dá)與芯片結(jié)果相符,其中,miR221差異性表達(dá)最明顯。 2、miR-221可能通過靶基因ARID1A及wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。 3、twist2正性調(diào)控miR221的表達(dá),促進(jìn)其在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。 4、提出一個新的調(diào)控機(jī)制,即miR-221在twist2轉(zhuǎn)錄因子的正性調(diào)控下可能通過ARID1A及wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。 本項目的創(chuàng)新之處 1、已發(fā)現(xiàn)miR221在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用,而其與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未見報道。 2、提出了一個新的miR221表達(dá)調(diào)控機(jī)制,選題具有很好的原始創(chuàng)新性和鮮明的研究特色。 3、闡明twist2/miR221/ARID1A在宮頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制,將為腫瘤轉(zhuǎn)移的診治、預(yù)后及藥物篩選提供新的基因和miRNA靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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1 張春智;敲低miR-221和miR-222表達(dá)對膠質(zhì)瘤的抑制作用及機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

2 常征;MiR-221在前列腺癌雄激素非依賴轉(zhuǎn)變過程中作用的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

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本文編號：1699226