本文選題：IK細胞因子　切入點：子宮內(nèi)膜癌　出處：《天津醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科三大惡性腫瘤之一,在最近十年發(fā)病率及致死率明顯上升,已成為最常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)病理學類型子宮內(nèi)膜癌又可以被分為I型子宮內(nèi)膜癌(雌激素依賴型)及II型子宮內(nèi)膜癌(非雌激素依賴型)。其中I型子宮內(nèi)膜癌占子宮內(nèi)膜癌的大多數(shù)(70-80%),大部分預后較好,病理類型主要為子宮內(nèi)膜樣腺癌。盡管I型子宮內(nèi)膜癌總的預后大體跟國際婦產(chǎn)科協(xié)會(FIGO)分期及腫瘤級別相關(guān),然而,對于具有相同或者類似組織學類型的I型子宮內(nèi)膜癌患者來說,仍有一些特定的患者對治療的反應及預后不近相似。所以單純依靠組織學及病理學類型來評估子宮內(nèi)膜癌的臨床預后,特別是I型子宮內(nèi)膜癌,顯得不是很充足,需要進一步的分型確定。另外對于子宮內(nèi)膜癌的治療,除了標準的手術(shù)術(shù)式,鉑類藥物為代表的化療也是最常用的治療方法,但是鉑類化療藥只在敏感的腫瘤細胞中才可以造成DNA損傷及細胞凋亡,沒有完整DNA修復途徑的腫瘤細胞對DNA損傷造成的凋亡更敏感,更容易死亡,因此,弱化DNA修復的能力似乎可以解決化療耐藥,從而使腫瘤病人得到更好的治療效果。我們課題組的前期研究顯示,部分晚期(IV組)子宮內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌患者的預后比早期的(II組)患者要好,而且只有IV組患者有IK基因的突變。所以IK基因的突變有可能和子宮內(nèi)膜癌患者的臨床預后有關(guān)。目前對于IK細胞因子在子宮內(nèi)膜癌中的研究尚無報道,課題組對美國癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(TCGA)中子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)進一步的分析指出IK基因突變的類型主要是移碼突變,此突變類型可以引起IK蛋白表達的缺失,是一種失活性突變。并且IK基因的突變與IK基因的低表達具有相關(guān)性,與子宮內(nèi)膜癌患者的預后呈正相關(guān)。所以本研究利用人來源子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa及KLE細胞通過體外實驗探討IK的下調(diào)對子宮內(nèi)膜癌可能造成的影響及其作用機制。第一部分IK細胞因子的缺失對子宮內(nèi)膜癌細胞生長的影響目的:探討IK蛋白的下調(diào)對子宮內(nèi)膜癌細胞系生長的影響方法:采用si RNA轉(zhuǎn)染的方法下調(diào)IK蛋白,并在轉(zhuǎn)染24小時,48小時及72小時后采用Western blot的方法檢測下調(diào)的結(jié)果;采用細胞活力實驗(CCK-8)、克隆形成實驗、細胞凋亡實驗(Anexin V-FITC/PI雙染色法)、細胞死亡實驗(Trypan blue染色法)及細胞周期實驗(PI染色法)分別檢測IK的下調(diào)對子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa及KLE細胞的活力、增殖、凋亡、死亡及細胞周期的影響。并利用western blot的方法檢測細胞自噬相關(guān)蛋白,利用吖啶橙染色法確定IK下調(diào)時導致的細胞陽性染色率。并且利用凋亡抑制劑(Q-VD-OPH)及自噬抑制劑(3MA),采用Trypan blue染色法分別檢測當子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)IK的蛋白表達下降導致細胞死亡時,其是否對細胞死亡造成影響。結(jié)果:Si RNA轉(zhuǎn)染的方法可以下調(diào)IK的蛋白表達,以轉(zhuǎn)染48小時及72小時后更為明顯。并且IK的下調(diào)可以抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa及KLE細胞的活力及增殖。在IK si RNA轉(zhuǎn)染48小時和72小時后,還可導致細胞周期G2/M期的阻滯,細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1表達水平下降,IK的下調(diào)還可活化半胱天冬酶(caspase)3、7、8及9,并降低抗凋亡蛋白BCL-2的蛋白表達,增加凋亡指示蛋白cleaved PARP的蛋白表達,導致細胞凋亡及死亡。IK的下調(diào)還可以導致細胞自噬相關(guān)蛋白LC3BI向LC3BII轉(zhuǎn)化,P62蛋白表達下降,吖啶橙染色陽性率提高。應用細胞凋亡抑制劑(Q-VD-OPH)后可以減少細胞死亡率,而應用細胞自噬抑制劑(3MA)后,細胞死亡率反而增加。結(jié)論:IK的下調(diào)可以抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa及KLE細胞的正常生長,抑制細胞有絲分裂的正常進行,促進細胞凋亡性的死亡。第二部分IK細胞因子的缺失對子宮內(nèi)膜癌細胞DNA損傷修復通路的影響及其作用機制的研究目的:探討IK蛋白的下調(diào)對子宮內(nèi)膜癌細胞系DNA損傷修復通路的影響及其可能的作用機制。方法:Si RNA轉(zhuǎn)染72小時后,采用DNA損傷檢測試劑盒,γ-H2AX免疫熒光染色的方法及western blot的方法檢測IK的下調(diào)對子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa及KLE細胞DNA損傷的影響;利用同源重組修復試劑盒及非同源末端連接修復檢測法檢測IK的下調(diào)對DNA修復通路的影響;在DNA損傷的情況下,利用蛋白質(zhì)譜分析及免疫沉淀法檢測可能與IK結(jié)合的相關(guān)DNA修復蛋白,并用免疫沉淀法進一步分析IK的下調(diào)可能對蛋白結(jié)合能力造成的影響;利用細胞活力實驗、細胞凋亡實驗及細胞死亡實驗檢測IK的下調(diào)是否使子宮內(nèi)膜癌細胞對順鉑作用更敏感。結(jié)果:Si RNA轉(zhuǎn)染72小時后,IK的下調(diào)可以導致子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa及KLE細胞的DNA損傷,γ-H2AX的細胞染色陽性率增多,western blot結(jié)果也證實γ-H2AX的蛋白表達增多。IK的下調(diào)還導致同源重組及及非同源末端連接DNA修復能力下降。DNA損傷的情況下,蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果顯示IK可以與非同源末端連接關(guān)鍵蛋白Ku80結(jié)合,進一步的免疫沉淀結(jié)果也證實了此結(jié)果。并且免疫沉淀結(jié)果證實IK的下調(diào)可以抑制Ku80與Ku70的異二聚體化的能力;IK的下調(diào)使子宮內(nèi)膜癌細胞對順鉑的作用更加敏感,下調(diào)IK并且同時應用順鉑可以顯著降低細胞的活力,促進細胞凋亡及死亡。結(jié)論:IK的下調(diào)可以造成子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa及KLE細胞的DNA損傷并通過抑制Ku80與Ku70的異二聚體化進而抑制其DNA修復通路;IK的下調(diào)使子宮內(nèi)膜癌細胞對順鉑的作用更加敏感。綜上所述,IK的突變主要是移碼突變,一種失活性突變,其突變與m RNA及蛋白表達具有相關(guān)性,并且與子宮內(nèi)膜癌患者的臨床預后呈正相關(guān)。體外實驗證實IK的下調(diào)可以抑制DNA修復通路,促進DNA損傷進而抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的正常生長,其作用機制可能與IK的下調(diào)抑制Ku80及Ku70異二聚體化的能力有關(guān),并且IK的下調(diào)使子宮內(nèi)膜癌細胞對順鉑的作用更加敏感,將來可作為子宮內(nèi)膜癌治療的一個新靶點。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

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本文編號：1681121