本文選題：活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測　切入點(diǎn)：形態(tài)選擇性卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：[研究背景]現(xiàn)代社會(huì),越來越多的育齡期夫婦面對不孕不育問題的困擾,這些不孕不育夫妻中約40%是男方由因素引起,其中50%的不育男性精子畸形率表現(xiàn)異常,且這一比例有上升的趨勢。男方精液質(zhì)量異常也越發(fā)成為導(dǎo)致不育的重要因素。自1992年ICSI(卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射)技術(shù)成功使因男性因素導(dǎo)致的不孕不育夫婦獲得妊娠以來,眾多因男方精液質(zhì)量異常的不孕不育夫婦獲得了較滿意的助孕結(jié)局。ICSI的常規(guī)適應(yīng)癥為：1、嚴(yán)重的少、弱、畸精子癥(嚴(yán)重少精子癥：一次射精的活精子濃度1×106/ml；少弱畸精子癥：精子濃度20×106/m1,同時(shí)a+b級(jí)運(yùn)動(dòng)精子20%和／或精子形態(tài)異常率85%；弱畸精子癥：精子濃度20×106/ml,正常形態(tài)精子10%,同時(shí)a+b級(jí)運(yùn)動(dòng)精子50%；(此標(biāo)準(zhǔn)為按照第四版《WHO人類精液檢查與實(shí)驗(yàn)室處理手冊》提供的正常精液參考值評定)；2、兩次以上不明原因IVF-ET受精失敗或受精率低于30%；3、卵母細(xì)胞體外成熟治療周期；需行植入前胚胎遺傳學(xué)檢查者；4、射精異常者；5、由各原因引起的不可逆性的梗阻性無精子癥；6、非梗阻性無精子癥,如生精功能障礙導(dǎo)致的無精子癥等。ICSI的受精率高達(dá)70%,在很大成都上提高了精子質(zhì)量較差患者的受精率,成為人類輔助生殖發(fā)展史上的第二場革命,解決了部分不育男性的生育問題。精子形態(tài)與精子功能密切相關(guān),精子形態(tài)學(xué)分析結(jié)果被認(rèn)為是對自然懷孕、IUI(宮腔內(nèi)人工授精)、IVF成功受孕率最有預(yù)測性的指標(biāo)。在常規(guī)ICSI中,操作者通常采用低倍鏡(×200-400)對精子頭部、頸部、尾部進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、挑選,然而,在該放大倍數(shù)下往往只能對精子進(jìn)行較為籠統(tǒng)的觀察,一些細(xì)微的精子形態(tài)結(jié)構(gòu)異常常無發(fā)被觀察到,可能會(huì)有一些超微結(jié)構(gòu)異常的精子越過自然選擇的屏障,被人為地注射入卵母細(xì)胞,最終導(dǎo)致早期胚胎分裂發(fā)育阻滯。這些可能是導(dǎo)致ICSI治療周期失敗的原因之一。近年來,很多學(xué)者致力于挑選精子技術(shù)的研究,試圖通過更高倍數(shù)的放大系統(tǒng)觀察精子的細(xì)微結(jié)構(gòu),并探討精子細(xì)微形態(tài)結(jié)構(gòu)異常與其內(nèi)部生理功能異常的關(guān)系,其中影響最為廣泛的為Bartoov在2001年提出的MSOME(活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測)技術(shù),以及將MSOME技術(shù)與傳統(tǒng)ICSI相結(jié)合而來的IMSI(精子形態(tài)選擇性胞漿內(nèi)單精子注射)技術(shù),IMSI技術(shù)將在更高放大倍數(shù)(×6600-×13000)下對精子頭部、頂體、頂體后區(qū)、頸部、線粒體、尾部這6個(gè)細(xì)胞器進(jìn)行實(shí)時(shí)的、精確的觀察,最終挑選到有活力且細(xì)微形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的精子,注射入卵母細(xì)胞。其中精子頭部是否含空泡以及空泡的大小是判斷精子形態(tài)正常與否的關(guān)鍵指標(biāo)。對于IMSI的具體適應(yīng)指征方面,目前有許多相關(guān)報(bào)道指出,對于多次ICSI治療周期失敗的患者,應(yīng)用IMSI技術(shù)能夠獲得較高的種植率、臨床妊娠率,降低流產(chǎn)率。除了反復(fù)ICSI失敗的患者,也有研究指出,IMSI能提高畸精子癥患者的種植率、臨床妊娠率。有研究將IMSI技術(shù)應(yīng)用于圓頭精子癥的患者,挑選出形態(tài)正常的精子注射入卵母細(xì)胞,最終獲得成功分娩。Knez等學(xué)者在IMSI技術(shù)對胚胎發(fā)育影響的研究中指出：IMSI能顯著提高治療周期的囊胚形成率。然而,也有一些報(bào)道指出IMSI技術(shù)不并不能改善助孕結(jié)局。因此,IMSI對于不育患者的治療效果及其主要的適應(yīng)癥仍未明確。與此同時(shí),MSOME放大系統(tǒng)下觀察到的精子細(xì)微形態(tài)結(jié)構(gòu)異常與其內(nèi)部病理生理學(xué)的關(guān)系,也成為許多學(xué)者研究的焦點(diǎn),其中,被研究最為廣泛的是：精子空泡與高DNA碎片發(fā)生率的相關(guān)性;然而,染色質(zhì)凝集異常、染色體結(jié)構(gòu)異常、高的非整倍體發(fā)生率等這些遺傳物質(zhì)異常也可能與精子細(xì)微結(jié)構(gòu)異常存在相關(guān)性,這些細(xì)微結(jié)構(gòu)的異常是否與精子遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性相關(guān),以及是否會(huì)通過ICSI操作影響受精過程及后續(xù)胚胎的發(fā)育,這些問題并沒有得到深入研究。因此,IMSI技術(shù)是否能夠改善不育患者的治療結(jié)局、能夠顯著改善哪一類患者的助孕結(jié)局,以及經(jīng)過挑選后的精子可能是通過哪些機(jī)制來改善助孕結(jié)局等問題需要我們進(jìn)行進(jìn)一步研究分析。[目的]1、使用活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測(MSOME)系統(tǒng)系統(tǒng)對不育男性患者的精子進(jìn)行形態(tài)選擇性卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)(IMSI),觀察IMSI技術(shù)能否改善因男性精液問題而不孕不育夫婦的助孕結(jié)局。2、使用活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測(MSOME)系統(tǒng)對不育患者的精液樣本進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析,定義新的MSOME系統(tǒng)參數(shù),分析這些MSOME參數(shù)與傳統(tǒng)常規(guī)精液參數(shù)及卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)周期助孕結(jié)局之間的關(guān)系,最終確立一個(gè)最有意義的MSOME參數(shù)并探討其對不育患者的診斷價(jià)值及ICSI周期助孕結(jié)局的預(yù)測價(jià)值。3、通過MALBAC單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合二代測序的方法(CNV-Seq)對活精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測(MSOME)系統(tǒng)下挑選的不同形態(tài)的單個(gè)精子進(jìn)行染色體核型的分析,探討MSOME系統(tǒng)下觀察到的精子形態(tài)異常與染色體核型異常的相關(guān)性從而發(fā)掘MSOME系統(tǒng)該善ICSI患者助孕結(jié)局的相關(guān)機(jī)制。[研究方法]1、回顧分析四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心2013年1月至2014年11月共82例梗阻性無精子癥患者,將行TESA(經(jīng)皮睪丸穿刺抽吸精子術(shù))獲得的睪丸精子通過放大系統(tǒng)(×6600)挑選后行卵母細(xì)胞注射(IMSI組),2013年1月至2014年11月共91例梗阻性無精子癥患者經(jīng)TESA取精術(shù)后行常規(guī)卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI組);2014年1月至11月共44例畸精子癥患者行形態(tài)選擇性包漿內(nèi)單精子注射治療(IMSI組),2014年1月至11月共71例畸精子癥患者行常規(guī)ICSI治療(ICSI組)。統(tǒng)計(jì)分析ICSI組和IMSI組患者的實(shí)驗(yàn)室結(jié)局和臨床結(jié)局。2、選取50例在四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行ICSI治療的少、弱、畸精子癥患者,將每位患者的精液樣本分成兩份,一份進(jìn)行常規(guī)精液分析；另一份精液樣本經(jīng)過預(yù)處理后首先在常規(guī)ICSI周期低倍鏡下(×400)挑選出形態(tài)正常的活精子30個(gè),隨后使用MSOME放大系統(tǒng),在高倍鏡(×6600)下對經(jīng)過低倍鏡挑選出的活精子進(jìn)行細(xì)胞器形態(tài)學(xué)檢測分析,并統(tǒng)計(jì)相關(guān)MSOME參數(shù)(二次挑選后的MSOME正常形態(tài)精子率、MSOME頭部大空泡精子率),將MSOME參數(shù)與常規(guī)精液參數(shù)、男方年齡、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率進(jìn)行相關(guān)分析。將MSOME參數(shù)、女方年齡、不孕年限、男方常規(guī)精液參數(shù)等對助孕結(jié)局的影響采用Logistic回歸分析,并用受試者工作曲線(ROC)對回歸模型進(jìn)行分析。若Logistic回歸方程提示存在MSOME參數(shù)對妊娠結(jié)局的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則運(yùn)用受試者工作曲線(ROC)分析該MSOME參數(shù)對ICSI周期助孕結(jié)局的預(yù)測價(jià)值,并最終確定一個(gè)MSOME參數(shù)臨界值用來預(yù)測ICSI周期患者的助孕結(jié)局。3、選取3例于2015年5月-2015年12月在四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行ICSI治療的重度少弱畸精子癥患者,于取卵日當(dāng)天囑患者手淫方式排精,將每位患者的精液樣本分成兩份,一份進(jìn)行常規(guī)精液分析；另一份精液樣本經(jīng)過預(yù)處理后在MSOEM放大系統(tǒng)(×6600)下進(jìn)行觀察挑選,每份樣本中挑選10條形態(tài)正常的活動(dòng)精子以及20條頭部存在大空泡(空泡面積4%頭部面積)的活動(dòng)精子。接著對每條精子進(jìn)行單精子全基因組擴(kuò)增(WGA)在平均0.02x深度下進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)變異分析CNV-Seq,從而發(fā)現(xiàn)非整倍體、染色體大片段增加或缺失、非平衡易位等染色體核型異常。[結(jié)果]1、梗阻性無精子癥患者中正常受精率IMSI組顯著高于ICSI組(84.3% vs 77.0%) (P0.05); ICSI組的卵裂率95.5%,優(yōu)胚率28.2%,囊胚形成率54.8%,種植率26.4%,臨床妊娠率47.3%,流產(chǎn)率14%,梗阻性無精子癥IMSI組患者的卵裂率96.7%,優(yōu)胚率29.2%,囊胚形成率54.3%,種植率32.3%,臨床妊娠率50.0%,流產(chǎn)率7.3%,兩組無顯著性差異(P0.05)�；影Y患者的正常受精率IMSI組顯著高于ICSI組(68% vs 75.5%)(P0.05),囊胚形成率IMSI組顯著高于ICSI組(54.6% vs 67.9%) (P0.05), ICSI組的卵裂率96.2%,優(yōu)胚率27.6%,種植率28.2%,臨床妊娠率43.7%,流產(chǎn)率9.7%; IMSI組患者的卵裂率95.2%,優(yōu)胚率27.1%,種植率30.7%,臨床妊娠率43.2%,流產(chǎn)率10.5%,兩組無顯著性差異(P0.05)。2、兩個(gè)MSOEM參數(shù)均與常規(guī)精液參數(shù)中的正常精子百分比及囊胚形成率存在相關(guān)性(p0.05)。二次挑選后的MSOME正常形態(tài)精子率與正常精子百分比、囊胚形成率呈正相關(guān)(R=0.670, P=0.000; R=0.513, P=0.000),與其他常規(guī)精液參數(shù)、ICSI周期的受精率、卵裂率、D3優(yōu)胚率、囊胚形成率無相關(guān)性(p0.05);二次挑選后MSOME頭部大空泡精子率與正常精子百分比、囊胚形成率呈負(fù)相關(guān)(R=-0.566, P=0.000; R=-0.356, P=0.003),與其他常規(guī)精液參數(shù)、ICSI周期的受精率、卵裂率、D3優(yōu)胚率、囊胚形成率無相關(guān)性(p0.05)。二次挑選后MSOME頭部大空泡精子率、a級(jí)精子比、a+b級(jí)精子比對生化妊娠的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；另一MSOME參數(shù)(二次挑選后的MSOME正常形態(tài)精子率)及其他因素對生化妊娠的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；多因素Logistic回歸模型對生化妊娠結(jié)局有預(yù)測價(jià)值(ROC曲線下面積為0.890,敏感度為90.91%,特異性為84.6%)；MSOME參數(shù)(二次挑選后MSOME頭部大空泡精子率)對生化妊娠結(jié)局有預(yù)測價(jià)值(ROC曲線下面積為0.828),同時(shí)分析得到一個(gè)最佳臨界值56.2%(敏感度為86.96%,特異性為69.23%),將56.2%作為平均MSOME頭部大空泡精子率的臨界值,根據(jù)這一取值對50例納入研究的患者進(jìn)行分組(A組n=35、B組n=15),結(jié)果顯示：A、B兩組在卵裂率(98.0%vs 91.5%)、生化妊娠率(61.8% vs 7.1%)、種植率(81.0% vs 0)上有顯著性差異(p0.05)；受精率、囊胚形成率、D3優(yōu)胚率無顯著性差異(p0.05)。3、3名重度少弱畸精子癥患者共36條單精子,其中24條含空泡精子中檢測出染色體核型異常精子14條,多條常染色體缺失或增加精子12條,染色體大片段缺失或增加的精子1條,出現(xiàn)XX/XY/YY二體畸形的精子4條；12條形態(tài)正常精子中檢測出染色體核型異常精子5條,其中多條常染色體缺失或增加精子5條,染色體大片段缺失或增加的精子0條,出現(xiàn)XX/XY/YY二體畸形的精子1條。[結(jié)論]1、梗阻性無精子癥患者的睪丸精子經(jīng)放大系統(tǒng)選擇后行ICSI,正常受精率較傳統(tǒng)ICSI有顯著性提高；畸精子癥患者射出的精液標(biāo)本經(jīng)放大系統(tǒng)挑選后行ICSI,正常受精率、囊胚形成率較傳統(tǒng)ICSI有顯著性提高。2、兩個(gè)MSOME參數(shù)均與精子常規(guī)參數(shù)中的正常精子百分比具有相關(guān)性,而且都影響ICSI周期中的后期胚胎發(fā)育情況；二次挑選后MSOME頭部大空泡精子率、a級(jí)精子比、a+b級(jí)精子這三項(xiàng)影響因素比對生化妊娠結(jié)局的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且MSOME參數(shù)綜合其他相關(guān)影響因素對預(yù)測ICSI治療周期的妊娠結(jié)局有一定的臨床意義；在本研究中我們確立了一個(gè)MSOME參數(shù)(二次挑選后MSOME頭部大空泡精子率)的臨界值,同時(shí)證明了這一參數(shù)與ICSI妊娠結(jié)局的關(guān)系,這一MSOME參數(shù)(二次挑選后MSOME頭部大空泡精子率)可作為獨(dú)立因素用來預(yù)測ICSI治療周期的妊娠結(jié)局。3、本實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSOME系統(tǒng)觀察的頭部含大空泡精子(4%頭部體積)與正常形態(tài)精子的非整倍體發(fā)生率無顯著性差異,但較后者有上升趨勢,這可能是由于納入本次實(shí)驗(yàn)的單精子數(shù)量有限導(dǎo)致。MSOME系統(tǒng)可降低挑選到染色體核型異常的精子,這可能是前期試驗(yàn)中證實(shí)的IMSI技術(shù)可提高畸精子癥患者助孕結(jié)局的潛在機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R714.8

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本文編號(hào)：1665621