本文選題：極光激酶A/B　切入點：乳腺癌易感蛋白1/2　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一,卵巢惡性上皮性腫瘤死亡率居首,嚴(yán)重威脅著全球女性的健康。Ras是腫瘤中最常見的癌基因,70%以上的卵巢癌中可檢測到Ras蛋白過度表達(dá)。Ras可以激活許多下游信號通路,其中包括Aurora kinases家族和Stanniocalcin家族。第一部分Ras相關(guān)Aurora kinases和基因組不穩(wěn)定性相關(guān)腫瘤發(fā)生的機(jī)理研究背景極光激酶(Aurora kinases)是一個絲/蘇氨酸蛋白激酶家族,位于Ras信號通路下游,與細(xì)胞有絲分裂相關(guān),且在多種腫瘤中有高表達(dá),是一種重要的癌基因。卵巢癌和胰腺癌中常同時存在極光激酶A/B (Aurora kinase A/B, AurA /B)的激活或乳腺癌易感蛋白1/2 (Breast cancer susceptibility protein 1/2, BRCA1/2)的失活。AurA/B和BRCA1/2之間的不平衡可能影響腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的發(fā)生,但是,這些分子之間的相互作用和調(diào)控腫瘤發(fā)生的機(jī)制仍不清楚。目的研究AurA/B和BRCA1/2之間的相互調(diào)節(jié)對腫瘤發(fā)生的影響,為優(yōu)化AurA/B和BRCA1/2相關(guān)腫瘤的診斷和治療提供指導(dǎo)。方法卵巢癌細(xì)胞株OVCA433和在胰腺癌細(xì)胞株Capan-1中,用特定shRNA單獨或聯(lián)合沉默AurA/B或／和BRCA1/2,檢測所獲細(xì)胞株中AurA/B 和BRCA1/2蛋白和mRNA的水平,并研究這些細(xì)胞的增殖能力、平板克隆形成能力、細(xì)胞周期分布及相關(guān)蛋白的表達(dá)、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞多核性、染色體四倍體性和裸鼠成瘤能力。結(jié)果在卵巢癌細(xì)胞系OVCA433中,AurA沉默增加BRCA1/2的表達(dá),但對AurB的表達(dá)影響不明顯；干擾AurB的表達(dá)促進(jìn)AurA和BRCA1/2的表達(dá),同時沉默BRCA1/2明顯提高AurA的表達(dá)而不影響AurB。在BRCA2基因功能缺陷的胰腺癌細(xì)胞株C apan-1中,AurA和AurB的蛋白表達(dá)相互補(bǔ)充,AurA和AurB沉默后BRCA1的表達(dá)上調(diào),BRCA1沉默后AurA降低,AurB變化不明顯。在這兩株細(xì)胞中,同時沉默AurA和AurB明顯提高BRCA1/2的表達(dá)。單獨或聯(lián)合干擾AurA/B口/或BRCA1/2對其他基因的mRNA水平?jīng)]有影響。用MG132處理細(xì)胞后,AurA/B和BRCA1/2蛋白之間的相互影響消失。干擾AurA和／或AurB的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、減少平板克隆形成數(shù)、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程,而干擾BRCA1和／或BRCA2促進(jìn)細(xì)胞增殖、增加平板克隆形成數(shù)、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,同時干擾AurA/B和BRCA1/2抵消AurA/B或BRCA1/2對細(xì)胞增殖、平板克隆形成能力和細(xì)胞周期的影響。沉默AurA/B和/或BRCA1/2引起一系列周期蛋白變化,其中比較一致的是p53和cyclin A。沉默AurA和/或AurB增加p53蛋白的表達(dá)、減少cyclin A的表達(dá),而沉默BRCA1和/或BRCA2降低p53水平、增加cyclin A水平,同時沉默AurA/B和BRCA1/2中和AurA/B或BRCA1/2對p53和cyclin A的影響。相比于對照組,低表達(dá)AurA和/或AurB的細(xì)胞系細(xì)胞多核性和染色體四倍體性降低,而低表達(dá)BRCA1和/或BRCA2細(xì)胞多核性和染色體四倍體性提高,AurA/B和BRCA1/2同時低表達(dá)的細(xì)胞系中細(xì)胞多核性和染色體四倍體性與對照組細(xì)胞相當(dāng)。在有絲分裂末期,兩種細(xì)胞中AurA/B和BRCA1/2均同時定位于中間體,但Capan-1細(xì)胞中BRCA1在中間體的累積不明顯。沉默AurA和/或AurB增加BRCA2在中間體上的表達(dá),對BRCA1影響不明顯,沉默BRCA1和/或BRCA2增加AurA/B在中間體的累積。在裸鼠成瘤實驗中,相比于對照組,低表達(dá)AurA和/或AurB的細(xì)胞系腫瘤生長慢,而低表達(dá)BRCA1和/或BRCA2的細(xì)胞系腫瘤生長快,同時低表達(dá)AurA/B和BRCA1/2的細(xì)胞系腫瘤生長快于AurA和/或AurB干擾組,而慢于BRCA1和/或BRCA2干擾組。結(jié)論AurA/B和BRCA1/2之間相互負(fù)性調(diào)節(jié),并反相影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞多核性、四倍體性和腫瘤的發(fā)生。干擾AurA和／或AurB的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、減少平板克隆形成數(shù)、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程,而干擾BRCA1和／或BRCA2促進(jìn)細(xì)胞增殖、增加平板克隆形成數(shù)、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,同時干擾AurA/B和BRCA1/2抵消AurA/B或BRCA1/2對細(xì)胞增殖、平板克隆形成能力和細(xì)胞周期的影響。沉默AurA/B和/或BRCA1/2引起一系列周期蛋白變化,其中比較一致的是p53和cyclin A。沉默AurA和/或AurB增加p53蛋白的表達(dá)、減少cyclin A的表達(dá),而沉默BRCA1和/或BRCA2降低p53水平、增加cyclin A水平,同時沉默AurA/B和BRCA1/2中和AurA/B或BRCA1/2對p53和cyclin A的影響。相比于對照組,低表達(dá)AurA和/或AurB的細(xì)胞系細(xì)胞多核性和染色體四倍體性降低,而低表達(dá)BRCA1和/或BRCA2細(xì)胞多核性和染色體四倍體性提高,AurA/B和BRCA1/2同時低表達(dá)的細(xì)胞系中細(xì)胞多核性和染色體四倍體性與對照組細(xì)胞相當(dāng)。在有絲分裂末期,兩種細(xì)胞中AurA/B和BRCA1/2均同時定位于中間體,但Capan-1細(xì)胞中BRCA1在中間體的累積不明顯。沉默AurA和/或AurB增加BRCA2在中間體上的表達(dá),對BRCA1影響不明顯,沉默BRCA1和/或BRCA2增加AurA/B在中間體的累積。在裸鼠成瘤實驗中,相比于對照組,低表達(dá)AurA和/或AurB的細(xì)胞系腫瘤生長慢,而低表達(dá)BRCA1和/或BRCA2的細(xì)胞系腫瘤生長快,同時低表達(dá)AurA/B和BRCA1/2的細(xì)胞系腫瘤生長快于AurA和/或AurB干擾組,而慢于BRCA1和/或BRCA2干擾組。結(jié)論AurA/B和BRCA1/2之間相互負(fù)性調(diào)節(jié),并反相影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞多核性、四倍體性和腫瘤的發(fā)生。第二部分Ras下游Stanniocalcin2在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)理背景分泌型蛋白斯鈣素(Stannbcalcin, STC)在魚類中參與調(diào)節(jié)鈣磷平衡。人類STC包含STC1和STC2兩個成員,均和多種腫瘤有關(guān)。RAS轉(zhuǎn)化的卵巢癌細(xì)胞中STC1水平升高,并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生,但STC2在卵巢癌中的作用還不清楚。目的研究STC2在卵巢癌發(fā)生中的作用及機(jī)制,為卵巢癌的診斷及治療提供思路。方法首先在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中轉(zhuǎn)染HA-tag標(biāo)記的STC2 cDNA,以證明分泌型蛋白STC2可以作用于自身細(xì)胞；然后在一系列卵巢癌細(xì)胞系中用STC2shRNA或cDNA沉默或過表達(dá)STC2,以系統(tǒng)研究STC2對卵巢癌細(xì)胞增殖、平板克隆、周期進(jìn)程、對順鉑和紫杉醇的敏感性及細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；并構(gòu)建動物模型,以觀察STC2在體內(nèi)的作用；最后構(gòu)建人高級別漿液性卵巢癌和正常卵巢的組織芯片,分析STC2與患者生存期的關(guān)系。結(jié)果STC2可以分泌至細(xì)胞外,再從胞外結(jié)合到細(xì)胞膜上。在Hey、Hey A8、 OVCA420、OVCA429細(xì)胞中,干擾STC2的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖和平板克隆形成、促進(jìn)G1-S周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞對順鉑和紫杉醇的敏感性,促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲；相反,在A2780、SKOV3、SKOV3 ip1細(xì)胞中,過表達(dá)STC2促進(jìn)細(xì)胞增殖和平板克隆形成、促進(jìn)G1-S周期過渡、抑制順鉑和紫杉醇引起的凋亡,抑制細(xì)胞遷移和侵襲。低表達(dá)STC2的細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK2、CDK4、CDK6表達(dá)較對照組低,而促凋亡蛋白Bax、Bid和cytoC表達(dá)較高；抑存活并促轉(zhuǎn)移蛋白p38、pp38表達(dá)升高,STAT3表達(dá)升高或不變,pSTAT表達(dá)下調(diào)；MEK、ERK1、 pERK1/2蛋白的表達(dá)沒有明顯變化；過表達(dá)STC2的細(xì)胞中以上蛋白變化趨勢相反。在裸鼠皮下移植瘤實驗中,干擾Hey細(xì)胞中的STC2抑制腫瘤生長,過表達(dá)SKOV3 ip1細(xì)胞中的STC2促進(jìn)腫瘤生長；在裸鼠腹腔種植轉(zhuǎn)移模型中,低表達(dá)STC2促進(jìn)腹腔種植轉(zhuǎn)移,而過表達(dá)STC2抑制腹腔轉(zhuǎn)移灶的形成。STC2在卵巢癌組織中高表達(dá),而在正常卵巢組織中幾乎不表達(dá)。高表達(dá)STC2的患者有更長的無進(jìn)展生存期和總生存期。結(jié)論STC2促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和耐藥并促進(jìn)腫瘤生長,但抑制細(xì)胞遷移侵襲并抑制腹腔種植轉(zhuǎn)移,STC2高表達(dá)可能和卵巢癌患者較好的預(yù)后相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

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本文編號：1657901